Ciblage des Thiols de cystéine pour in Vitro in situ Glycosylation des protéines recombinantes

Stocker les exploités de calcium (Ca^{2 +}) entrée (SOCE) est la principale voie par laquelle les cellules immunitaires prennent Ca^{2 +} de l’espace extracellulaire dans le cytosol. Dans les lymphocytes T, lymphocytes T récepteurs situés sur la membrane plasmique (PM) lient antigènes qui activent la protéine-tyrosine kinases (évaluées à ^1,2,3). Une cascade de phosphorylation entraîne l’activation de la phospholipase-γ (PLCγ) qui intervient par la suite dans l’hydrolyse de la membrane phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP₂) en diacylglycérol et inositol 1,4,5-trisphosphate (IP₃ ). IP₃ est un petit Messager diffusible qui se lie aux IP₃ récepteurs (IP₃R) sur le réticulum endoplasmique (re) ainsi ouvrir ce canal récepteur et permis Ca^{2 +} s’écouler dans le gradient de concentration de l’ER Lumen dans le cytosol (évaluée à ⁴). Signalisation des protéines G couplées et récepteurs à tyrosine kinase dans une variété d’autre cellules excitables et non-excitables types plomb pour la même production d’IP₃ et l’activation des IP₃Rs de récepteur.

En raison de la Ca^{2 +} stockage capacité finie de l’urgence, l’IP₃-communiqué de la médiation et augmentation résultante cytosolique Ca^{2 +} est seulement transitoire ; Toutefois, cette diminution de l’ER luminale Ca^{2 +} effets profondément stromales interaction molécule-1 (STIM1), un type-je transmembranaires (TM) protéines surtout présents sur la membrane de ER ^5,6,7. STIM1 contient un lumen orienté Ca^{2 +} détection domaine composé d’une paire de main EF et du α-motif (EFSAM). Coiled-coil de cytosolique axé sur trois domaines sont séparés des EFSAM par le seul domaine de TM (évaluée à ⁸). Sur ER luminale Ca^{2 +} l’appauvrissement, EFSAM subit une oligomérisation couplés déstabilisation ^7,9 , qui provoque des réarrangements structuraux de la TM et domaines coiled-coil ¹⁰. Ces changements structurels aboutissent à un piégeage de STIM1 ER-PM jonctions ^11,12,13,14 , grâce à des interactions avec les PM phosphoinositides ^{15, 16} et Orai1 sous-unités ^17,18. Orai1 protéines sont les sous-unités de PM qui assemblent pour former Ca^{2 +} canaux ^19,20,21,22. Les interactions de STIM1-Orai1 au niveau des jonctions ER-PM facilitent une Ca^{2 +} déblocage activé Ca^{2 +} (CRAC) canal conformation ouverte qui permet le mouvement de Ca^{2 +} dans le cytosol de la concentration élevée de la espace extracellulaire. Dans les cellules immunitaires, les soutenue cytosolique Ca^{2 +} élévations via les canaux CRAC induisent la Ca^{2 +}– calmoduline/calcineurine dépendante déphosphorylation du facteur nucléaire des lymphocytes T activés qui par la suite entre le noyau et commence la régulation transcriptionnelle des gènes favorisant l’activation de lymphocytes T ^1,3. Le processus d’activation canal CRAC par STIM1 ^23,24 via induite par l’agoniste ER luminale Ca^{2 +} l’appauvrissement et la résultante soutenue cytosolique Ca^{2 +} élévation est collectivement appelé SOCE ²⁵. Le rôle vital de SOCE en lymphocytes T est évident par les études qui ont démontré que des mutations héréditaires dans les STIM1 et les Orai1 peuvent causer des déficit immunitaire combiné sévère syndromes ^{3,19,26, 27}. EFSAM initie SOCE après détection ER-luminale Ca^{2 +} épuisement par la perte de Ca^{2 +} coordination à la main EF canonique, conduisant finalement à la déstabilisation couplés auto-association ^{7, 28,},²⁹.

La glycosylation est la covalente et la transformation des structures oligosaccharide, également connu sous le nom de glycanes, à travers différentes étapes biosynthétiques de l’ER et Golgi (évaluée à ^30,32,,³³). Il existe deux types prédominants de glycosylation chez les eucaryotes : N-liés et O-liée, selon les acides aminés spécifiques et l’atome de la liaison de raccordement. Dans la N– glycosylation, glycanes sont attachés à l’amide de chaîne latérale de l’Asn, et dans la plupart des cas, l’étape d’initiation se produit dans la salle d’urgence comme le polypeptide chaîne se déplace dans le lumen ³⁴. La première étape de la N– glycosylation est le transfert d’une structure de base de quatorze-sucre composé de glucose (Glc), mannose (Man) et N– acétylglucosamine (GlcNAc) (c.-à-d. Glc₃Man₉GlcNAc₂) de l’ER membrane lipidique par un oligosaccharyltransferase ^35,36. Des mesures supplémentaires, telles que le clivage ou le transfert des résidus de glucose, sont catalysées aux urgences par des glycosyltransférases et glycosidases spécifiques. Certaines protéines qui quittent la salle d’urgence et passer dans l’appareil de Golgi peuvent être encore transformés ³⁷. O– glycosylation se réfère à l’ajout des glycanes, habituellement au groupe hydroxyle côté chaîne de résidus Ser ou Thr, et cette modification a été apportée tout à fait dans l’appareil de Golgi ^33,34. Il y a plusieurs structures de O– glycanes qui peuvent être constitués de N– acétylglucosamine, fucose, galactose et l’acide sialique avec chaque monosaccharide ajouté séquentiellement ³³.

Alors qu’aucune séquence spécifique n’a été identifié comme condition sine qua non pour de nombreux types de O– glycosylation, une séquence consensus commun a été associée avec le N-liée modification : Asn-X-Ser/Thr/Cys, où X peut être n’importe quel acide aminé sauf Pro ³³. STIM1 EFSAM contient deux de ces sites de glycosylation – consensus N: Asn131-Trp132-Thr133 et Asn171-Thr172-Thr173. En effet, des études antérieures ont montré que EFSAM peut être N– glycosylées en cellules mammifères Asn131 et Asn171 ^38,39,40,41. Toutefois, des études antérieures des conséquences de la N– glycosylation sur SOCE ont été incongrues, suggérant supprimée, potentialise ou pas d’effet de cette modification post-traductionnelle SOCE activation ^38,= « xref » > 39^,40,41. Ainsi, la recherche sur les conséquences structurels, biochimiques et biophysiques sous-jacents de EFSAM N– glycosylation est essentielle pour comprendre les effets régulateurs de cette modification. En raison de l’exigence pour les niveaux élevés de protéines homogènes dans ces expériences in vitro , a appliqué une approche sélective des site pour attacher par covalence moitiés de glucose à EFSAM. Fait intéressant, Asn131 et Asn171 de glycosylation causé des changements structurels qui convergent dans le cœur EFSAM et d’améliorer les propriétés biophysiques qui favorisent la médiation STIM1 SOCE ⁴².

La fixation chimique du glycosyl groupes thiols Cys a été bien établie par un ouvrage qui tout d’abord démontré l’utilité de cette approche sans enzymes pour comprendre les effets propres au site de glycosylation sur protéine fonction ^{43 , 44}. plus récemment et en ce qui concerne les STIM1, les résidus Asn131 et Asn171 ont été mutés à Cys et glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] a été utilisé de façon covalente lier glucose à thiols libres ⁴². Nous décrivons ici, cette approche qui non seulement utilise mutagénèse d’incorporer les résidus Cys spécifiques de site pour modification, mais s’applique également à spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) solution pour évaluer rapidement l’efficacité modification tant structurels perturbations suite à la glycosylation. Notamment, cette méthodologie générale est facilement adaptable pour étudier les effets de l’ O– ou N– glycosylation d’une inoculation produit protéique.