Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Armazene operado de cálcio (Ca^{2 +}) entrada (SOCE) é a principal via pela qual as células imunes ocupam Ca^{2 +} do espaço extracelular para o citoplasma. Em linfócitos T, células T receptores situados na membrana plasmática (PM) ligam antígenos que ativam quinases de proteína tirosina (revistos em ^1,2,3). Uma cascata de fosforilação leva à ativação da fosfolipase-γ (PLCγ), que posteriormente, Medeia a hidrólise da membrana fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP₂) em diacilglicerol e inositol 1, 4,5-triphosphate (IP₃ ). IP₃ é um pequeno mensageiro diffusible que liga ao IP₃ receptores (IP₃R) sobre o retículo endoplasmático (ER), assim, abrindo este canal receptor e permitindo Ca^{2 +} para fluir para baixo o gradiente de concentração da emergência lúmen para o citosol (revisto em ⁴). Receptor de sinalização da proteína G acoplada e receptores de tirosina quinase em uma variedade de outra células não-excitáveis e excitável tipos chumbo para a mesma produção de IP₃ e a ativação do IP₃Rs.

Devido a Ca^{2 +} armazenamento capacidade finita do PS, o IP₃-liberação mediada e resultante aumento citosólico Ca^{2 +} é apenas transitório; no entanto, esta depleção do ER luminal Ca^{2 +} profundamente efeitos do estroma interação molécula-1 (STIM1), um tipo-eu transmembrana (TM) proteína encontrada principalmente no ER membrana ^5,6,7. STIM1 contém um lúmen-orientado Ca^{2 +} sensoriamento domínio composto por um par de EF-mão e estéril α-motif (EFSAM). Três domínios coiled-coil citosólica orientado são separados da EFSAM pelo domínio do TM único (revisto em ⁸). Em cima de ER luminal Ca^{2 +} da prostração, EFSAM sofre uma desestabilização acoplados oligomerização ^7,9 que faz com que rearranjos estruturais do TM e domínios coiled-coil ¹⁰. Estas mudanças estruturais culminaram em uma captura de STIM1 ER-PM entroncamentos ^11,12,13,14 através de interações com remodelamento PM ^{15, 16} e de Orai1 subunidades ^17,18. Orai1 proteínas são as subunidades de PM que montam para formar Ca^{2 +} canais de de^{21, 19,20,22}. As interações de STIM1-Orai1 nos cruzamentos de ER-PM facilitam uma aberto Ca^{2 +} lançamento ativado Ca^{2 +} (CRAC) canal conformação que permite a circulação de Ca^{2 +} para o citosol das altas concentrações do no espaço extracelular. Em células do sistema imunológico, as sustentado citosólico Ca^{2 +} elevações através de canais de CRAC induzem a Ca^{2 +}– calmodulina/calcineurina dependente desfosforilação do fator nuclear das células T ativadas que posteriormente entra no núcleo e começa o Regulamento transcricional de genes, promovendo a ativação de células T ^1,3. O processo de ativação de canal CRAC por STIM1 ^23,24 via induzida pelo agonista ER luminal Ca^{2 +} depleção e a resultante sustentado citosólico Ca^{2 +} elevação é coletivamente denominado SOCE ²⁵. O papel vital da SOCE em células T é evidente por estudos demonstrando que hereditários mutações em ambos os STIM1 e Orai1 podem causar imunodeficiência combinada grave síndromes ^{3,19,26, 27}. EFSAM inicia SOCE após detecção ER-luminal Ca^{2 +} depleção através da perda de Ca^{2 +} coordenação no canônico EF-lado, finalmente levando à desestabilização acoplados auto associação ^{7, 28,29}.

Glycosylation é a ligação covalente e processamento de estruturas de oligossacarídeo, também conhecido como os glicanos, através de várias etapas biossintéticas no ER e Golgi (revisto em ^30,32,33). Existem dois tipos predominantes de glicosilação em eucariontes: N-vinculado e O-ligada, dependendo do aminoácido específico e átomo colmatar o enlace. Na N– glicosilação, os glicanos são anexados a amida de cadeia lateral do Asn, e na maioria dos casos, a etapa de iniciação ocorre no PS como o polipeptídeo cadeia move-se para o lúmen ³⁴. O primeiro passo do N– glicosilação é a transferência de uma núcleo de quatorze-açúcar estrutura composta de glicose (Glc), manose (homem) e N– acetilglicosamina (GlcNAc) (ou seja, Glc₃homem₉GlcNAc₂) da emergência lipídios de membrana por uma oligosaccharyltransferase ^35,36. Outras medidas, tais como a clivagem ou transferência de resíduos de glicose, são catalisadas nas urgências por glycosyltransferases e glicosidases específico. Algumas proteínas que deixe o ER e mover para o Golgi podem ser ainda mais processados ³⁷. O– glicosilação refere-se à adição dos glicanos, geralmente para o grupo hidroxila de cadeia lateral de resíduos Ser ou Thr, e essa modificação ocorre inteiramente no complexo de Golgi ^33,34. Existem várias estruturas de glicano – Oque podem ser feitas de N– acetilglicosamina, fucose, galactose e ácido siálico com cada monossacarídeo adicionado sequencialmente ³³.

Enquanto nenhuma sequência específica foi identificada como pré-requisito para muitos tipos de O– glicosilação, uma sequência de consenso comum tem sido associada com a N-ligados a modificação: Asn-X-Ser/Thr/Cys, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro ³³. STIM1 EFSAM contém dois desses sites – glicosilação do consenso N: Asn131-Trp132-Thr133 e Asn171-Thr172-Thr173. De fato, estudos anteriores mostraram que EFSAM pode ser N– glicosilados em células de mamíferos em Asn131 e Asn171 ^38,39,40,41. No entanto, estudos anteriores sobre as consequências da N– glicosilação na SOCE tem sido incongruentes, sugerindo suprimida, potencializado ou nenhum efeito por esta modificação borne-translational na SOCE ativação ^38,= “xref” > 39 de^40,,41. Assim, a investigação sobre as consequências de biofísicas, bioquímicas e estruturais subjacentes de EFSAM N– glicosilação é vital para compreender os efeitos regulatórios da modificação. Devido à exigência de altos níveis de proteínas homogêneas nesses experimentos em vitro , foi aplicada uma abordagem local-seletiva covalentemente anexar partes de glicose para EFSAM. Curiosamente, Asn131 e Asn171 de glicosilação causou mudanças estruturais que convergem dentro do núcleo EFSAM e aumentar as propriedades biofísicas que promovem SOCE mediada por STIM1 ⁴².

O sistema químico de glycosyl grupos de tióis Cys tem sido bem estabelecido por uma obra seminal que primeiro demonstrou a utilidade desta abordagem de enzima livre para entender os efeitos específicos do site da glicosilação na proteína função ^{43 , 44}. mais recentemente e com respeito a STIM1, os resíduos de Asn131 e Asn171 foram uma mutação de Cys e glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] foi usado para ligar covalentemente glicose para a enciclopédia tióis ⁴². Aqui, descrevemos esta abordagem que não só usa o mutagenesis de incorporar resíduos de Cys local específicos para a modificação, mas também se aplica a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) solução para avaliar rapidamente a eficiência de modificação e estrutural perturbações como resultado da glicosilação. Notavelmente, esta metodologia geral é facilmente adaptável para estudar os efeitos de ambos O– ou N– glicosilação de qualquer recombinantes produzidos a proteína.