In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.
Abstract
Metodologie attuali per l’uccisione di antigene-specifiche sono limitate per uso in vitro o utilizzati in modelli di malattie infettive. Tuttavia, c’è non un protocollo specificamente destinato a misurare antigene-specifiche uccisione senza un’infezione. Questo protocollo è stato progettato e descrive i metodi per superare queste limitazioni, consentendo per la rilevazione dell’antigene-specifiche uccidendo una cella obiettivo di CD8+ T cells in vivo. Ciò avviene mediante l’Unione di un modello di vaccinazione con un tradizionale CFSE-etichetta target uccidendo il dosaggio. Questa combinazione consente al ricercatore di valutare il potenziale CTL di antigene-specifiche direttamente e velocemente come il dosaggio non è dipendente della crescita del tumore o infezione. Inoltre, la lettura si basa sulla citometria a flusso e quindi dovrebbe essere facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La limitazione principale dello studio consiste nell’identificare la timeline in vivo che è appropriato per l’ipotesi in fase di test. Variazioni nella forza di antigene e mutazioni nelle cellule T che possono derivare in funzione citolitica differenziale devono essere attentamente valutati per determinare il momento ottimale per la raccolta delle cellule e valutazione. La concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per hgp10025-33 e OVA257-264, ma occorrerebbero ulteriori convalida per altri peptidi che potrebbero essere più appropriati per un determinato studio. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.
Introduction
Protocolli multipli esistono per valutare il potenziale citolitica (CTL) di un CD8+ o CD4+ T-cellula. Questa valutazione può essere facilmente fatto in vitro sotto condizioni controllate1,2,3. Inoltre, modelli di malattia infettiva, come LCMV, classicamente hanno esaminato la funzione CTL attraverso l’uso di differenzialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) etichettati cellule bersaglio dove il CFSECiao-sono cellule con etichettate ha pulsato con un peptide e CFSElo-pulsati cellule rimangono contrassegnati dell’obiettivo. Le cellule sono poi iniettate con un rapporto 1:1 e valutate per la perdita della CFSECiao-etichettato pulsati obiettivi di flusso cytometry4. Modelli di vaccino e rifiuto hanno utilizzato anche strategie simili per valutazione di in vivo uccidendo entrambi CD8+ e CD4+ T cellule così come cellule NK5,6. Questo è un potente, ma richiede l’uso di agenti infettivi che innescano il sistema immunitario prima dell’iniezione di destinazione.
Questo protocollo, d’altra parte, non richiede nessuna infezione priore dell’host e invece utilizza una strategia di vaccinazione per primo il sistema immunitario prima dell’iniezione di destinazione. Questa vaccinazione è composto da una formulazione a base di acqua di vaccino del peptide che richiede la fornitura di un immunostimolante cocktail chiamato covax7, costituito da un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonistico l’anticorpo e l’interleuchina 2 (il-2) che conduce alla combinazione sinergica di immunostimulatory agenti per l’ottenimento dei peptidi specifici adescamento e risposta immunitaria robusta. Come tale, questo test fornisce una rapida lettura della funzione CTL come il vaccino è somministrato insieme con le cellule per la valutazione della funzione solo tre giorni prima dell’iniezione delle cellule bersaglio. Inoltre, l’innesco di covax è abbastanza forte che si può vedere la capacità di uccisione della cellula T antigene-specifiche innescata tra 4 e 24 h dopo l’iniezione.
La limitazione principale di questo protocollo è l’identificazione della timeline in vivo per la rilevazione dell’uccisione di destinazione che è opportuno sia l’antigene e l’ipotesi da testare. Attenta valutazione deve essere effettuata, come variazioni nella forza di antigene così come le alterazioni genetiche in cellule di T in fase di test potrebbe causare funzione differenziale di CTL che richiederebbe un rilevamento di tempi diversi di uccisione di destinazione. Inoltre, mentre la concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per melanoma umano antigene glicopeptide 100 (hgp10025-33) e ovoalbumina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso di un altro modello di antigene che può essere più appropriato per un dato studio richiederebbe ulteriore convalida. A causa delle differenze attese nella capacità degli antigeni di un obiettivo di stimolare la CTL effettrici funzione in combinazione con il covax come adiuvante, ottimizzazione della frequenza di concentrazione e dose dose IL-2 può essere essenziale per raggiungere l’obiettivo desiderato. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre questo protocollo è molto semplice, ci sono pochi passaggi critici che devono essere eseguite con cautela. L’innesco di covax dopo l’iniezione della cellula-T antigene-specifiche in fase di test è necessario vedere qualsiasi uccisione degli obiettivi pulsati. Mentre è possibile che la vaccinazione di base acqua covax crea uno stato infiammatorio acuto, per la fase infiammatoria cronica, sostituendo la formulazione a base di acqua di breve durata con un approccio basato su olio di antigene lento rilascio può pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da ricerche di NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), Grant di ricerca istituzionali (RN), Start-up concedere (RN) e seme di MD Anderson CIC concedere (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
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