En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación
Summary
El objetivo de este protocolo es permitir la detección de en vivo matando de una célula de la blanco en un modelo murino de específica de antígeno.
Abstract
Las metodologías actuales para la matanza de específica de antígeno son limitadas para uso in vitro o utilizadas en modelos de enfermedades infecciosas. Sin embargo, existe no un protocolo diseñado específicamente para medir el antígeno específico homicidio sin una infección. Este protocolo está diseñado y se describen métodos para superar estas limitaciones por lo que permite la detección de antígeno específico matando de una célula diana por CD8 células+ T en vivo. Esto se logra por la fusión de un modelo de vacunación con el objetivo marcado con CFSE tradicional matando a ensayo. Esta combinación permite al investigador evaluar el potencial CTL específica de antígeno directamente y rápidamente como el ensayo no es dependiente sobre el crecimiento del tumor o infección. Además, la lectura se basa en citometría de flujo y por lo tanto debe ser accesible a la mayoría de los investigadores. La principal limitación del estudio es identificar la línea de tiempo en vivo que sea apropiada a la hipótesis de ser probada. Variaciones en fuerza de antígeno y mutaciones en las células de T que pueden producir la función citolítica diferencial deben ser evaluados cuidadosamente para determinar el momento óptimo para la cosecha celular y la evaluación. La concentración adecuada de péptidos para la vacunación ha sido optimizada para hgp10025-33 y OVA257-264, pero además se necesitarían validación de otros péptidos que pueden ser más apropiados para un determinado estudio. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.
Introduction
Existen múltiples protocolos para evaluar el citolíticos (CTL) potencial de un CD8+ o CD4+ T-cell. Esta evaluación puede hacerse fácilmente en vitro en condiciones controladas1,2,3. Además, modelos de enfermedades infecciosas, tales como LCMV, clásicamente han examinado la función CTL a través diferencialmente CFSE (-(and 6) 5-Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster) etiquetado como células diana donde la CFSEhi-las células marcadas están pulsada con un péptido y CFSElo-destino etiquetado células quedan unpulsed. Las células son inyectadas en una proporción 1:1 y evaluó la pérdida de la CFSEHola-etiquetado objetivos pulsadas por citometría de flujo4. Vacuna y rechazo de modelos también han utilizado estrategias similares para la evaluación de en vivo de la matanza por ambos CD8+ y CD4+ T las células así como NK células5,6. Esto es un ensayo potente, pero requiere el uso de agentes infecciosos y que prime el sistema inmunológico antes de la inyección de destino.
Este protocolo, por el contrario, requiere una infección previa del huésped y en su lugar utiliza una estrategia de vacunación para cebar el sistema inmunológico antes de la inyección de destino. Esta vacuna se compone de una formulación a base de agua de vacuna peptídica que requiere la provisión de un inmunoestimulador cóctel llamado covax7, que consiste en un peaje-como el receptor 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonística anticuerpo y la interleucina-2 (IL-2) a la combinación sinérgica de los agentes inmunoestimulantes para la obtención de péptidos específicos cebado y respuesta inmune robusta. Como tal, este ensayo proporciona una lectura rápida de la función CTL como la vacuna se administra junto con las células para la evaluación de la función de sólo tres días antes de la inyección de las células diana. Además, el cebado covax es lo suficientemente fuerte como para que la capacidad de matanza de la célula de T específicas de antígeno preparada puede verse entre 4 y 24 h después de la inyección.
La limitación principal de este protocolo es identificar la línea de tiempo en vivo para la detección de la matanza de destino apropiado para el antígeno y la hipótesis ensayada. Cuidadosa evaluación debe realizarse, como variaciones en la fuerza de antígeno así como alteraciones genéticas siendo probado en las células T podría resultar en función diferencial de CTL que requiera una detección de diferentes tiempos de asesinato de destino. Además, si bien la concentración adecuada de péptido de vacunación ha sido optimizada para el antígeno de melanoma humano glicopéptido 100 (hgp10025-33) y ovoalbúmina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso de otro modelo de antígeno que puede ser más apropiado para un determinado estudio requiere mayor validación. Debido a diferencias esperadas en la capacidad de los antígenos de un objetivo para estimular la función efectora CTL en combinación con el covax como coadyuvante, optimización de la frecuencia de dosis y concentración de dosis IL-2 puede ser esencial para lograr el objetivo deseado. En general, este protocolo permite una evaluación rápida de la función en vivo y puede ser adaptado a cualquier antígeno determinado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben realizarse con cuidado. El cebado covax después de la inyección de la célula de T específicas de antígeno sometido a prueba es necesario ver todo asesinato de objetivos pulsados. Aunque es posible que la vacunación a base de agua covax crea una condición inflamatoria aguda, para la fase inflamatoria crónica, cambiar la formulación a base de agua de breve duración con un enfoque de base de aceite de liberación lenta del antígeno puede pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la investigación de NIH (A1R03AI120027 (RN) y 1R21AI20012 (RN)), beca de investigación institucional (RN), puesta en marcha conceder (RN), y semilla de MD Anderson CIC concede (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
