Summary

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Published: November 28, 2017
doi:

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

Abstract

Aktuelle Methoden zur antigenspezifischen Tötung sind beschränkt auf in-vitro- Verwendung oder bei Infektionskrankheiten Modelle verwendet. Allerdings gibt es kein Protokoll speziell antigenspezifischen töten ohne eine Infektion zu messen. Dieses Protokoll dient und beschreibt Methoden, um diese Einschränkungen zu überwinden, indem es ermöglicht für den Nachweis von Antigen-spezifische Tötung von einer Zielzelle durch CD8+ T-Zellen in Vivo. Dies geschieht durch eine Impfung-Modell mit einem traditionellen CFSE–markierten Ziel töten Assay zusammenführen. Diese Kombination erlaubt es den Forscher, die Antigen-spezifische CTL Potenzial zu bewerten, direkt und schnell, da der Test nicht Tumorwachstum oder Infektion abhängig ist. Darüber hinaus das Auslesen basiert auf Durchflusszytometrie und so die meisten Forscher leicht zugänglich sein sollten. Die große Einschränkung der Studie ist die Zeitachse in Vivo identifizieren, die die Hypothese getestet werden. Variationen in Antigen Stärke und Mutationen in T-Zellen, die im Differenzial Zytolyse-Funktion ergeben müssen sorgfältig geprüft werden, um den optimalen Zeitpunkt für die Zellernte und Bewertung zu bestimmen. Die entsprechende Konzentration des Peptids für die Impfung wurde optimiert für hgp10025-33 und OVA257-264, aber weitere Validierung für andere Peptide, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie benötigt werden würde. Insgesamt dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

Introduction

Mehrere Protokolle gibt es zur Beurteilung der Zytolyse (CTL) Potenzials eine CD8+ oder CD4+ T-Zellen. Diese Einschätzung kann ohne weiteres in Vitro unter kontrollierten Bedingungen1,2,3erfolgen. Darüber hinaus haben Infektionskrankheit Modelle, wie z. B. LCM, CTL-Funktion durch den Einsatz von differentiell CFSE-(5-(and 6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester) mit der Bezeichnung Zielzellen klassisch geprüft wo die CFSE-Hallo-markierte Zellen sind gepulst mit einem Peptid und CFSE-lo-ungepulsten beschrifteten Ziel Zellen sind links. Die Zellen sind dann im Verhältnis 1:1 gespritzt und bewertet für den Verlust von den CFSE-Hallo-gepulste Ziele von Flow Cytometry4beschriftet. Impfstoff und Ablehnung Modelle haben auch ähnliche Strategien zur Beurteilung der in Vivo zu töten, indem beide CD8 verwendet+ und CD4-Zellen sowie NK Zellen5,6+ T. Dies ist ein leistungsfähiges Assay, sondern erfordert die Verwendung von Infektionserregern, die das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime.

Dieses Protokoll auf der anderen Seite erfordert keine vorherige Infektion des Wirtes und nutzt stattdessen eine Impfstrategie um das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime. Diese Impfung ist eine wasserbasierte Formulierung der Peptid-Impfstoff, der Bereitstellung von einer immunstimulierenden cocktail namens Covax7, bestehend aus einem Toll-Like Rezeptor 7 (TLR7) erfordert bestehend Agonist (Imiquimod-Creme), eine agonistische Anti-CD40 Antikörper und Interleukin-2 (IL-2) führt zu synergistische Kombination von immunstimulierenden Agenten für die Erhebung von Peptid-spezifische Grundierung und robuste Immunantwort. Als solches bietet dieser Assay eine schnellere Auslesen der CTL-Funktion, da der Impfstoff nur drei Tage vor der Injektion von den Zielzellen zusammen mit den Zellen zur Beurteilung der Funktion verwaltet wird. Darüber hinaus ist die Covax Grundierung stark genug, dass die Tötung Kapazität des grundiert antigenspezifischen T-Zellen zwischen 4 und 24 h nach der Injektion gesehen werden kann.

Die größte Beschränkung dieses Protokolls ist die Zeitachse in Vivo für den Nachweis von Ziel Tötung identifizieren, die angebracht ist, das Antigen und die Hypothese getestet. Sorgfältige Bewertung durchgeführt werden muss, als Variationen in Antigen Stärke sowie genetische Veränderungen in T-Zellen getestet Differenzial CTL-Funktion führen, die eine Erkennung von unterschiedlichem Timing Ziel töten erfordern würde. Darüber hinaus zwar die entsprechende Konzentration des Peptids für Impfung für menschlichen Melanom Antigen Glycopeptide 100 (hgp10025-33) optimiert wurde und Ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , Verwendung eines anderen Antigen-Modells, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie würde weitere Validierung erfordern. Optimierung der IL-2 Dosis Konzentration und Dosis Frequenz möglicherweise aufgrund erwarteten Unterschiede in einem Ziel-Antigene Kapazität, CTL-Effektor-Funktion in Kombination mit der Covax als Adjuvans zu stimulieren muss das gewünschte Ziel zu erreichen. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt. 1. Vorbereitung des Peptids für den Impfstoff Auflösen der gefriergetrockneten Peptid mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf die entsprechende Konzentration und Wirbel für 30 s.Hinweis: Für hgp10025–33, die Endkonzentration ist 1 mg/mL und für OVA257<…

Representative Results

Vor der Injektion des CFSE–markierten Zielzellen läuft die Zelle 1:1-Mischung auf einem Durchflusszytometer bestimmen die Grundlinie Frequenzen CFSE-Hallo sowohl des CFSE-lo Zielzellen. Abbildung 1 A zeigt die gating Strategie zum Erkennen von Änderungen in der CFSE-Bevölkerung, eine erste Tor erfolgt über FSC und SSC-Parameter. Die gesamte CFSE–positiven Zellen sind dann vor der Bewertung der Änderungen in der Fr…

Discussion

Während dieses Protokolls sehr einfach ist, gibt es ein paar wichtige Schritte, die sorgfältig durchgeführt werden müssen. Die Covax Grundierung nach Injektion von antigenspezifischen T-Zellen getestet ist notwendig, um jegliches Töten der gepulsten Ziele zu sehen. Es ist zwar möglich, dass die wässrige Covax Impfung eine akute entzündliche Erkrankung, für die chronischen entzündlichen Phase schafft kann anstelle der kurzlebigen wasserbasierte Formulierung mit einem langsam-Antigen Version Öl basierenden Ansat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird unterstützt von der NIH Forschung (A1R03AI120027 (RN) und 1R21AI20012 (RN)), institutionelle Research Grant (RN), Start-up zu gewähren (RN) und MD Anderson CIC Samen zu gewähren (RN).

Materials

6- to 12-week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12-week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

References

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

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Cite This Article
Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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