Summary

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Published: November 28, 2017
doi:

Summary

O objetivo do presente protocolo é permitir detecção de in vivo matando de uma célula-alvo em um modelo murino de antígeno-específicas.

Abstract

Metodologias atuais para matar antígeno-específicas são limitadas para uso em vitro ou utilizadas em modelos de doenças infecciosas. No entanto, há não um protocolo especificamente concebido para medir o antígeno-específicas matança sem uma infecção. Este protocolo é projetado e descreve métodos para superar essas limitações, permitindo a detecção de antígeno-específicas matando de uma célula-alvo por CD8+ T células na vivo. Isso é realizado através da fusão de um modelo de vacinação com um alvo marcado CFSE tradicional matando o ensaio. Esta combinação permite que o pesquisador avaliar o potencial CTL antígeno-específicas diretamente e rapidamente como o ensaio não é dependente do crescimento do tumor ou infecção. Além disso, a leitura é baseada em citometria de fluxo e assim deve ser facilmente acessível para a maioria dos pesquisadores. A principal limitação do estudo é identificar o cronograma na vivo que é apropriado para a hipótese a ser testada. Variações na força de antigénio e mutações nas células T que podem resultar em função citolítica diferencial precisam ser cuidadosamente avaliada para determinar o momento ideal para colheita da pilha e avaliação. A concentração apropriada de peptídeo de vacinação foi otimizada para hgp10025-33 e óvulos257-264, mas ainda mais validação seria necessária para outros peptídeos que podem ser mais adequados para um determinado estudo. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

Introduction

Múltiplos protocolos existem para avaliar o potencial (CTL) citolítica de um CD8+ ou CD4+ células T. Esta avaliação pode ser facilmente feita em vitro sob condições controladas1,2,3. Além disso, modelos de doenças infecciosas, tais como LCMV, classicamente têm examinado a função CTL através do uso de diferencialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster) rotulada nas células-alvo onde o CFSEOi-pilhas etiquetadas são pulsado com um peptídeo e CFSEEis-etiquetado alvo, as células são deixadas unpulsed. As células são então injetadas na proporção de 1:1 e avaliados em relação à perda do CFSEOi-etiquetados pulsados alvos por citometria de fluxo4. Modelos de vacina e rejeição também usaram estratégias semelhantes para avaliação do na vivo matando por ambos os CD8+ e CD4+ T células bem como NK células5,6. Isto é um ensaio poderoso, mas requer o uso de agentes infecciosos que encha o sistema imunológico antes da injeção do alvo.

Este protocolo, por outro lado, não requer nenhuma infecção prévia do host e em vez disso, utiliza uma estratégia de vacinação para prime o sistema imunológico antes da injeção do alvo. Esta vacinação é composta por uma formulação à base de água de vacina de peptídeo que exige a prestação de um cocktail de immunostimulatory chamado covax7, consistindo de um receptor Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod creme), uma agonística anti-CD40 anticorpo e a interleucina-2 (IL-2) levando a combinação sinérgica de immunostimulatory agentes para o levantamento de escorva de peptídeo específico e robusta resposta imune. Como tal, este ensaio fornece uma leitura rápida da função CTL como a vacina é administrada junto com as células para avaliação da função de apenas três dias antes da injeção das células alvo. Além disso, a preparação de covax é forte o suficiente para que a capacidade de abate da célula T antígeno-específicas aprontada pode ser vista entre 4 e 24 h após a injeção.

A principal limitação do presente protocolo é identificar o cronograma na vivo para a detecção de matança de destino que é apropriada para o antígeno e a hipótese a ser testada. Cuidadosa avaliação deve ser realizada, como variações na força de antígeno, bem como alterações genéticas sendo testado em células T pode resultar em função CTL diferencial que exigiria uma detecção de temporização diferente de matar alvo. Além disso, enquanto que a concentração adequada de peptídeo para vacinação foi otimizada para melanoma humano antígeno glicopeptídeo 100 (hgp10025-33) e ovalbumina257-264 (óvulos257-264)8,9 , uso de outro modelo de antígeno que pode ser mais apropriado para um determinado estudo exigiria mais validação. Por causa de diferenças antecipadas na capacidade dos antígenos um alvo para estimular a função efetora CTL em combinação com o covax como adjuvante, otimização da frequência de concentração e dose de dose IL-2 pode ser essencial para atingir o objetivo desejado. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center e institucional Cuidado Animal. 1. preparação de peptídeo para a vacina Dissolver o liofilizado peptídeo com fosfato salino (PBS) para a concentração adequada e vórtice para 30 s.Nota: Para hgp10025–33, a concentração final é de 1 mg/mL e para óvulos257–264, a concentração…

Representative Results

Antes da injeção de células-alvo CFSE-etiquetadas, a mistura de 1:1 célula é executada em um citômetro de fluxo para determinar as frequências de linha de base de ambos o CFSEOi e CFSEEis nas células-alvo. Figura 1 A mostra a estratégia associada para detectar mudanças nas populações CFSE, um portão inicial é feito usando parâmetros de FSC e SSC. As células CFSE positivo totais então são subgated antes …

Discussion

Enquanto este protocolo é simples, existem alguns passos críticos que devem ser executados com cuidado. A escorva covax após injeção da antígeno-específicas células T sendo testada é necessária ver qualquer matança dos alvos pulsados. Embora seja possível que a vacinação covax à base de água cria uma condição inflamatória aguda, para a fase inflamatória crônica, substituindo a formulação de curta duração à base de água com uma abordagem baseada em óleo de liberação lenta-antigénio pode prod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pela pesquisa de NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), concessão de pesquisa institucional (RN), start-up conceder (RN) e semente de MD Anderson CIC concede (RN).

Materials

6- to 12-week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12-week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

References

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Cite This Article
Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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