אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון
Summary
המטרה של פרוטוקול זה נועד לאפשר זיהוי של in vivo הריגתו של תא המטרה במודל מאתר של אנטיגן ספציפי.
Abstract
מתודולוגיות הנוכחי לרצח אנטיגן ספציפי מוגבלים לשימוש במבחנה או שימוש במודלים מחלה זיהומית. עם זאת, יש לא פרוטוקול ספציפי נועד למדוד אנטיגן ספציפי הרג ללא זיהום. פרוטוקול זה תוכנן ומתאר שיטות להתגבר על מגבלות אלה ומאפשר זיהוי אנטיגן ספציפי הריגתו של תא המטרה על ידי CD8+ T תאים ויוו. זו מושגת על-ידי מיזוג מודל החיסון עם יעד התווית על-ידי CFSE מסורתי הורג וזמינותו. שילוב זה מאפשר החוקר להעריך את הפוטנציאל CTL אנטיגן ספציפי ישירות ובמהירות וזמינותו אינה תלויה הגידול או זיהום. בנוסף, המדידה מבוססת על cytometry זרימה, אז צריך להיות נגיש על רוב החוקרים. המגבלה העיקרית של המחקר היא לזהות את ציר הזמן ויוו שהולם ההשערה הנבדקת. וריאציות בעוצמתם אנטיגן מוטציות בתאי T שעלולה להיות דיפרנציאלית בפונקציה cytolytic צריך להעריך בזהירות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור תא הקציר והערכה. הריכוז המתאים של פפטיד לקבלת חיסון מוטבה hgp10025-33 , ביצית257-264, אך בהמשך יהיה נחוץ אימות עבור אחרים פפטידים שעשויים להיות מתאים יותר ממחקר נתון. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של הפונקציה ויוו , ניתן להתאים כל אנטיגן נתון.
Introduction
קיימים פרוטוקולים מרובים כדי להעריך את הפוטנציאל (CTL) cytolytic של CD8+ או CD4+ T-cell. ההערכה יכול להיעשות בקלות במבחנה תחת תנאים מבוקרים1,2,3. בנוסף, מודלים מחלה זיהומית, כגון LCMV, בחנו בסגנון קלאסי CTL פונקציה באמצעות באופן שונה CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר) שכותרתו התאים היעד בו CFSEשלום-תאים עם תוויות פעמו עם פפטיד, CFSEהלאו-שכותרתו היעד תאים נשארו unpulsed. התאים אז מוזרק ביחס של 1:1, שקובעת אובדן CFSEהיי-תווית פעמו מטרות באמצעות cytometry זרימה4. חיסון דגמים דחייה גם השתמשו אסטרטגיות דומות עבור הערכה של ויוו להרוג על ידי שני CD8+ ו CD4+ T תאים כמו גם תאי NK5,6. זה וזמינותו עוצמה, אך מחייב שימוש מדבקים זה פריים המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד.
פרוטוקול זה, מצד שני, דורש אין זיהום מוקדמת של המחשב המארח, במקום מנצל אסטרטגיה חיסון לשפר את המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד. לחיסון זה מורכבת ניסוח על בסיס מים של חיסון פפטיד המחייב מתן immunostimulatory קוקטייל בשם covax7, המורכב קולטן דמוי אגרה 7 (TLR7) אגוניסט (imiquimod קרם), של אנטי-CD40 היתה ללא-חת נוגדן, interleukin-2 (il-2) שמוביל שילוב סינרגיסטי של סוכנים immunostimulatory ההתמחרות פפטיד ספציפי לקרקע ואת התגובה החיסונית חזקה. ככזה, וזמינותו הזה מספק של הבדיקה מהירה של CTL פונקציה כמו החיסון ניתנת יחד עם התאים עבור הערכה של תפקוד רק שלושה ימים לפני הזרקה של תאי היעד. בנוסף, לקרקע covax הוא מספיק חזק, כי ניתן לראות את קיבולת הריגתו של תא T אנטיגן ספציפי להתקפת בין 4 ו- 24 שעות לאחר ההזרקה.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא לזהות את ציר הזמן ויוו עבור הגילוי של הריגת היעד המתאים אנטיגן והן את ההשערה הנבדקת. יש לבצע הערכה זהירה, כשלל וריאציות אנטיגן כוח, כמו גם שינויים גנטיים במקצועות תאי-T עלולה לגרום דיפרנציאלית בפונקציה CTL המחייב של זיהוי תזמון שונה היעד ההרג. בנוסף, בזמן הריכוז המתאים של פפטיד עבור חיסון מוטבה עבור מלנומה אנושית אנטיגן glycopeptide 100 (hgp10025-33) ו אובלבומין257-264 (ביצית257-264)8,9 , שימוש אחר מודל אנטיגן אשר עשוי להיות מתאים יותר ממחקר נתון ידרוש יותר אימות. בשל הבדלים קיבולת של אנטיגנים היעד לעורר CTL לתפקד אפקטור בשילוב עם covax כמו אדג’וונט הצפויה, אופטימיזציה של ריכוז המינון il-2 ותדירות המינון עשוי להיות חיוני להשגת המטרה הרצויה. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של הפונקציה ויוו , ניתן להתאים כל אנטיגן נתון.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד פרוטוקול זה היא פשוטה, ישנם כמה צעדים קריטיים זה חייב להתבצע בקפידה. לקרקע covax לאחר ההזרקה של אנטיגן ספציפי T-cell הנבדקת יש צורך לראות יש הריגתו של המטרות פעמו. אמנם זה אפשרי כי החיסון covax על בסיס מים יוצר תנאי דלקתית חריפה, עבור שלב דלקתי כרוני, החלפת ניסוח קצר על בסיס מים עם גישה המבוסס ע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מחקר NIH (A1R03AI120027 (RN) ו 1R21AI20012 (RN)), מענק מחקר מוסדיים (RN), סטארט-אפ הענק (RN) ו MD אנדרסון CIC זרע הענק (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
