Summary

生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

Published: November 28, 2017
doi:

Summary

このプロトコルの目的は、抗原特異的マウスモデルにおける標的細胞の殺害の生体内での検出を実現することです。

Abstract

抗原特異的殺害のための現在の方法論は生体外での使用に制限されるか伝染病モデルで利用します。しかし、抗原特異的感染せず殺害を測定する対象プロトコルではありませんがあります。このプロトコルは設計されています、特定の抗原の検出のため許可することでこれらの制限を克服する方法について説明します+ T 細胞の生体内でCD8 による標的細胞の殺害します。これは、アッセイを殺す伝統的な CFSE 分類されたターゲットと予防接種モデルのマージで。この組み合わせでは、アッセイは腫瘍の増殖や感染症に依存するないと直接かつ迅速に抗原特異的 CTL の可能性を評価するために研究者をことができます。また、読み出しはフローサイトメトリーに基づいており、ほとんどの研究者によって簡単にアクセスする必要があります。研究の主な制限は、タイムラインは、生体内でテストされる仮説に適切な見つけることです。抗原強度の変動と微分細胞傷害性機能可能性があります T 細胞における突然変異細胞収穫と評価のための最適な時間を決定するため慎重に評価する必要があります。Hgp10025-33の OVA257-264, ペプチド ワクチン接種のための適切な濃度を最適化されていますが、さらに検証が特定の調査により適切な場合があります他のペプチドの必要になります。全体的にみて、このプロトコルにより、体内の機能を殺すの迅速な評価と任意の特定の抗原に適応することができます。

Introduction

複数のプロトコルは、cd8 陽性の細胞傷害性 (CTL) の可能性を評価するために、+または CD4+ T 細胞。この評価は体外で制御された条件1,2,3の下で容易に行うことができます。さらに、脈絡などの感染症モデルは古典的な差動 CFSE (5-(and 6) Carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル) 標識ターゲット細胞を使用して CTL 機能を検討してきたところ、CFSEこんにちは-標識細胞がペプチドと CFSEloパルス-パルス成分を含まない細胞が残っているターゲット。セルが 1:1 の比率で注入し、CFSEこんにちはの損失を評価-流れ cytometry4パルス ターゲットをラベル付けします。ワクチンと拒絶反応のモデル生体内で両方 CD8 によって殺害の評価のため同様の戦略を使用しているも+と CD4+ T 細胞も NK 細胞5,6。プライム対象注入前に免疫システム感染エージェントを使用する必要が強力な試金。

このプロトコルは、他の一方で、ホストの先行感染を必要とせず、代わりにプライム対象注入前に免疫システムに予防接種戦略を利用します。このワクチン接種は免疫刺激、カクテルと呼ばれる covax7Toll 様受容体 7 (TLR7) から成るの規定を必要とするペプチド ワクチンの水ベースの製剤から成るアゴニスト (imiquimod クリーム)、アゴニスト抗 CD40抗体およびインターロイキン 2 (IL-2) ペプチドごとのプライミングと強力な免疫反応の免疫刺激剤の相乗組み合わせに 。など、この試金はワクチンが標的細胞の投与前に 3 日間だけ関数の評価のための細胞と一緒に投与は CTL 機能の迅速な読み出しを提供します。さらに、covax プライミング プライミングの抗原特異的 T 細胞の殺害容量を注入後 4 と 24 h の間見ることができる十分に強いです。

このプロトコルの主な制限は、タイムライン、生体内で抗原とテストされる仮説の両方に適している殺害の対象を検出するため見つけることです。慎重に評価を行う必要があります、遺伝的変化と同様に、抗原の強さの変動として T 細胞でテストされている可能性がありますターゲット殺害の異なるタイミング検出が必要となる微分の CTL 機能。また、一方、ペプチド濃度の適切なワクチン接種がヒトメラノーマ抗原ペプチド 100 (hgp10025-33) に最適化されています, 卵白アルブミン257-264 (OVA257-264)8,9 が特定の調査に適している別の抗原モデルの使用はさらに検証が必要があります。アジュバントとして、covax との組み合わせで CTL エフェクター機能を刺激するためにターゲット抗原の能力の予想される違いは、希望する目標を達成するために不可欠である IL-2 投与濃度、投与頻度の最適化があります。全体的に、このプロトコルは生体内での機能を殺すの迅速な評価を可能し、任意の特定の抗原に適応することができます。

Protocol

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) テキサス大学 MD アンダーソンがんセンターのによって承認されています。 1. ワクチンのペプチドの作製 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 30 の渦・適切な濃度と凍結乾燥ペプチドを溶解 s。注: hgp10025-33, 最終濃度が 1 mg/mL、OVA257-264, 最終濃度は 0…

Representative Results

CFSE 分類されたターゲット細胞の注入前にセルの 1:1 混合物が両方、CFSEこんにちはと CFSElo標的細胞の基準周波数を決定する流れの cytometer で実行されます。図 1FSC と SSC のパラメーターを使った初期のゲート、 Aは CFSE 個体数の変化を検出するゲートの戦略を示しています。この人口はラベルのない内因性脾細胞と比?…

Discussion

このプロトコルは簡単ですが、慎重に行う必要がありますいくつかの重要なステップがあります。テストされている抗原特異的 T 細胞の注入 covax プライミングはパルスのターゲットのいずれかの殺害を参照する必要。短時間の水ベースの製剤を置き換えて遅い抗原の放出性油ベースのアプローチより生じる水ベースの covax 予防接種、慢性炎症期の急性炎症性疾患を作成することが可能です?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は NIH の研究によってサポートされている (A1R03AI120027 (RN) と 1R21AI20012 (RN))、機関研究グラント (RN)、スタートアップは (RN) を付与、および MD アンダーソン CIC 種子 (RN) を付与します。

Materials

6- to 12-week old female C57BL/6 mice  Charles River 027 C57 Black 6 mice
OT-1 6-12-week old female mice  Jackson Labs 003831
hgp10025–33  CPCScientific 834139 KVPRNQDWL
OVA 257–264  CPCScientific MISC-012 SIINFEKL
Imiquimod cream 5%  Fougera 51672-4145-6 Aldara Cream
CD40-specific mAb  BioXcell BE0016-2 clone FGK4.5
rhIL-2 protein  Hoffman LaRoche Inc 136 Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep  Kendall S-17474
PBS Life Technologies 10010-023 Phosphate Buffered Saline
FBS Life Technologies 26140-079 fetal bovine serum
RBC lysis buffer  Life Technologies A10492-01 red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
L-Glutamine  Life Technologies 25030081
Pen/Strep Life Technologies 15140122 penicillin/streptomycin
CFSE Life Technologies C34554 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  A4503
1.5 mL MCT graduated natural  Fisher 05-408-129 microcentrifuge tube
70% ethanol Fisher BP8201500 EtOH
Trypan blue solution, 0.4%   Life Technologies 15250-061
Hemocytometer Fisher 267110
27 gauge needle BD 305109
1 mL syringe BD 309659

References

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Cite This Article
Haymaker, C. L., Hailemichael, Y., Yang, Y., Nurieva, R. In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model. J. Vis. Exp. (129), e56255, doi:10.3791/56255 (2017).

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