In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model
Summary
Het doel van dit protocol is dat voor de opsporing van in vivo antigeen-specifieke doden van een cel in een lymfkliertest model.
Abstract
Huidige methoden voor het doden van antigeen-specifieke zijn beperkt tot in vitro gebruik of gebruikt in modellen van besmettelijke ziekten. Er is echter niet een protocol dat specifiek bestemd voor de meting van antigeen-specifieke doden zonder een infectie. Dit protocol is ontworpen en een beschrijving van de methoden om deze beperkingen te overwinnen doordat voor de opsporing van antigeen-specifieke doden van een doelcel door CD8+ T cellen in vivo. Dit wordt bereikt door het samenvoegen van een vaccinatie-model met een traditionele CFSE-geëtiketteerden doel assay doden. Deze combinatie zorgt ervoor dat de onderzoeker te beoordelen van het potentieel van antigeen-specifieke CTL direct en snel als de test niet afhankelijk van de tumorgroei of een infectie is. Bovendien, de uitlezing is gebaseerd op stroom cytometry en dus moet gemakkelijk toegankelijk zijn voor de meeste onderzoekers. De belangrijkste beperking van de studie is het identificeren van de tijdlijn in vivo die past bij de hypothese wordt getest. Variaties in de sterkte van het antigeen en mutaties in de T-cellen die leiden differentiële cytolytische functie tot kunnen moeten zorgvuldig worden beoordeeld om te bepalen van de optimale tijd voor de oogst van de cel en beoordeling. De juiste concentratie van peptide voor vaccinatie is geoptimaliseerd voor hgp10025-33 en eicellen257-264, maar verdere validatie nodig zou zijn voor andere peptiden die meer geschikt voor een bepaalde studie wellicht. Globaal, is dit protocol maakt een snelle evaluatie van het doden van functie in vivo en kan worden aangepast aan een bepaald antigeen.
Introduction
Er zijn meerdere protocollen om te kunnen beoordelen cytolytische (CTL) of een CD8+ of CD4+ T-cel. Deze beoordeling kan gemakkelijk worden gedaan in vitro onder gecontroleerde omstandigheden1,2,3. Daarnaast infectieziekte modellen, zoals LCMV, klassiek CTL functie met behulp van differentieel CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl ester) label doelcellen hebben onderzocht waar de CFSEhi-gelabelde cellen zijn Pulsed met een peptide en CFSElo-gelabelde target cellen zitten unpulsed. De cellen vervolgens geïnjecteerd in een 1:1 verhouding en beoordeeld voor verlies van de CFSEhi-label gepulseerde doelstellingen door stroom cytometry4. Vaccin en afwijzing modellen hebben ook soortgelijke strategieën gebruikt voor beoordeling van het in vivo doden door beide CD8+ en CD4+ T cellen evenals NK cellen5,6. Dit is een krachtige test, maar vereist het gebruik van besmettelijke agentia die prime het immuunsysteem voorafgaand aan target injectie.
Dit protocol, aan de andere kant, vereist geen voorafgaande infectie van de gastheer en in plaats daarvan maakt gebruik van een vaccinatiestrategie te prime het immuunsysteem voorafgaand aan target injectie. Deze vaccinatie bestaat uit een watergedragen formulering van peptide vaccin waarvoor bepaling van een immunostimulerende cocktail genaamd covax7, bestaande uit een Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist (imiquimod crème), een agonistic anti-interactie CD40 antilichaam en interleukin-2 (IL-2) leidt tot synergetische combinatie van immunostimulerende agenten voor de verdieping van peptide-specifieke priming en robuuste immuunrespons. Als zodanig biedt deze test een snelle uitlezing van CTL functie zoals het vaccin wordt toegediend samen met de cellen voor de beoordeling van de functie slechts drie dagen vóór injectie van de doelcellen. Bovendien, is de covax-priming sterk genoeg dat de capaciteit van de doden van de primer antigeen-specifieke T cel worden tussen 4 en 24 uur na de injectie gezien kan.
De belangrijkste beperking van dit protocol is het identificeren van de tijdlijn in vivo voor de detectie van doel doden die geschikt is om zowel het antigeen en de hypothese wordt getest. Zorgvuldige beoordeling moet worden uitgevoerd, als variaties in antigeen sterkte, alsmede genetische wijzigingen wordt getest in T-cellen kan leiden tot differentiële CTL-functie die een andere timing detectie van het doden van de doelgroep vereisen zou. Bovendien, terwijl de juiste concentratie van peptide voor vaccinatie is geoptimaliseerd voor menselijke melanoom antigeen glycopeptide 100 (hgp10025-33) en ovoalbumine257-264 (eicellen257-264)8,9 , gebruik van een ander model van het antigeen die meer geschikt voor een bepaalde studie wellicht zou vereisen verdere validatie. Vanwege verwachte verschillen in een doel antigenen capaciteit ter stimulering van CTL effector functie in combinatie met de covax als adjuvans, kan optimalisatie van IL-2 dosis concentratie en dosis frequentie zijn essentieel om het gewenste doel te bereiken. Globaal, is dit protocol voorziet in een snelle beoordeling van het doden van functie in vivo en kan worden aangepast aan een bepaald antigeen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel dit protocol eenvoudig is, zijn er een paar essentiële stappen die moeten zorgvuldig worden uitgevoerd. De covax-priming na injectie van de antigeen-specifieke T-cel wordt getest is noodzakelijk om te zien alle doden van de gepulseerde doelstellingen. Hoewel het mogelijk is dat de vaccinatie watergedragen covax een acute inflammatoire aandoening, voor de chronische inflammatoire fase creëert, kan de kortstondige waterbasis formulering te vervangen door een langzaam-antigeen release olie gebaseerde aanpak leiden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de NIH onderzoek (A1R03AI120027 (RN) en 1R21AI20012 (RN)), institutionele onderzoek Grant (RN), start-up verlenen (RN) en MD Anderson CIC zaad verlenen (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
