Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için
Summary
Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.
Abstract
Antijen spesifik öldürmek için mevcut metodolojiler vitro kullanmak için sınırlı veya bulaşıcı hastalık modellerinde kullanılmaktadır. Ancak, değil özellikle enfeksiyon öldürmeden antijen spesifik ölçmek amacıyla bir protokol vardır. Bu iletişim kuralı tasarlanmıştır ve antijen spesifik tespiti için izin vererek bu sınırlamaları aşmak için yöntemler açıklanır hedef hücrenin CD8 tarafından öldürmek+ T hücreleri vivo içinde. Bu bir aşı modeli tahlil öldürmek bir geleneksel CFSE etiketli hedef ile birleştirerek gerçekleştirilir. Bu kombinasyon tahlil tümör büyüme veya enfeksiyon bağımlı olmadığı gibi antijen spesifik CTL potansiyel doğrudan ve hızlı bir şekilde değerlendirmek araştırmacı sağlar. Ayrıca, okuma Akış Sitometresi üzerinde temel alır ve bu yüzden çoğu araştırmacı için kolayca erişilebilir olması gerekir. Çalışmanın büyük sınırlama test edilen hipotez için uygun zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Antijen gücü değişimler ve fark cytolytic işlevinde neden olabilir T hücreleri mutasyonların hücre hasat ve değerlendirme için en uygun zamanı belirlemek için dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Peptid aşılama için uygun konsantrasyonu hgp10025-33 ve OVA257-264için optimize edilmiştir, ama daha fazla doğrulama için belirli bir çalışma daha uygun olabilir diğer peptidler için gerekli olacaktır. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.
Introduction
Birden çok iletişim kuralı bir CD8 cytolytic (CTL) potansiyelini değerlendirmek için mevcut+ veya CD4+ T hücre. Bu değerlendirme vitro kontrollü şartlar1,2,3altında kolayca yapılabilir. Buna ek olarak, bulaşıcı hastalık modelleri, LCMV gibi klasik CTL işlev hedef hücreleri etiketli differentially CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) aracılığıyla inceledik nerede CFSEMerhaba-etiketli hücreleri bir peptid ve CFSEloile geniş puls-etiketli hedef hücre are sol unpulsed. Hücreleri sonra bir 1:1 oranında enjekte ve kaybı CFSEMerhabaiçin değerlendirildi-darbeli hedefleri Akış Sitometresi4tarafından etiketli. Aşı ve ret modelleri de benzer stratejileri için kullanmış her iki CD8 tarafından öldürmek vivo içinde değerlendirilmesi+ ve CD4+ T hücreleri de5,6NK hücreleri. Bu güçlü bir tahlil ancak bağışıklık sistemi hedef enjeksiyon önce Başbakan enfeksiyöz ajanlar kullanımını gerektirir.
Bu iletişim kuralı, öte yandan, ana bilgisayarın önceki enfeksiyon gerektirir ve bunun yerine hedef enjeksiyon önce bağışıklık sistemi hazırlamak için bir aşı strateji kullanır. Bu aşı bir su bazlı bir immunostimulatory kokteyl covax7bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) oluşan, adı verilen hükmü gerektiren peptid aşı formülasyon oluşur agonist (imiquimod krem), agonistik bir anti-CD40 antikor ve immunostimulatory maddeleri, yaşla peptid özgü astar ve güçlü bağışıklık yanıtı için sinerjik birleşime önde gelen interleukin-2 (IL-2). Bu nedenle, aşı sadece üç gün önce hedef hücrelerin enjeksiyon ile birlikte işlev değerlendirmesi için hücreleri işletilmektedir gibi bu tahlil CTL işlevinin bir hızlı okuma sağlar. Buna ek olarak, covax astar yeterince güçlü astarlanmalıdır antijen spesifik T hücre öldürme kapasitesi 4 ile 24 h sonra enjeksiyon arasında görülebilir.
Bu protokol büyük sınırlama antijen ve test edilen hipotez için uygundur hedef öldürme tespiti için zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Dikkatli değerlendirme gerçekleştirilmelidir, varyasyonları antijen gücü hem de genetik değişiklikler olarak T-hücreleri test edilen hedef öldürme farklı zamanlama algılamaya gerektirecektir fark CTL işlevinde neden olabilir. Ayrıca, süre peptid uygun konsantrasyonu için aşı insan Melanom antijen glycopeptide 100 (hgp10025-33) için optimize edilmiş ve ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , belirli bir çalışma için daha uygun olabilir başka bir antijen model kullanımı daha fazla doğrulama gerektirir. CTL efektör fonksiyonu covax ile birlikte bir adjuvan olarak uyarmak için bir hedef antijenleri kapasite beklenen farklılıklar nedeniyle IL-2 doz konsantrasyon ve doz sıklığı duruma getirilmesi istenen hedefe ulaşmak için gerekli olabilir. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı basit olmakla birlikte, dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken birkaç önemli adımlar vardır. Enjeksiyon antijen spesifik T-hücre test edilen takip covax astar pulsed hedeflerinden herhangi bir öldürme görmek gereklidir. Kısa ömürlü su bazlı formülasyonu yavaş-antijen serbest yağ bazlı bir yaklaşımla yerine su bazlı covax aşı kronik enflamatuar faz için bir akut iltihabi durum oluşturur mümkün olsa daha iyi bir neden olabilir sonucu7,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH araştırma tarafından desteklenmektedir (A1R03AI120027 (RN) ve 1R21AI20012 (RN)), kurumsal araştırma hibe (RN), başlangıç (RN) vermek ve MD Anderson CIC tohum vermek (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
