أسلوب للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات المجهرية في مجهر إلكتروني
Summary
تقدم هذه الدراسة إجراءات موثوقة وسهلة للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات الدقيقة دون معدات باهظة الثمن في مجهر إلكتروني.
Abstract
مراقبة الخلايا ومكونات الخلية في الأبعاد الثلاثة في عالية التكبير في مجهر إلكتروني يتطلب إعداد المقاطع سامسونج التسلسلي للعينة. على الرغم من أن إعداد المقاطع سامسونج المسلسل يعتبر أن تكون صعبة للغاية، فمن السهل بدلاً من ذلك إذا تم استخدام الطريقة الصحيحة. وفي هذه الورقة نعرض إجراء خطوة بخطوة للحصول بأمان على أبواب سامسونج المسلسل من الكائنات الحية الدقيقة. النقاط الرئيسية لهذا الأسلوب: 1) استخدام جزء كبير من العينة وضبط حافة السطح وسكين العينة بحيث تكون موازية لبعضها البعض؛ 2) قطع مقاطع المسلسل في المجموعات وتجنب صعوبة في الفصل بين الفروع باستخدام زوج من خيوط الشعر عند استرداد مجموعة من مقاطع المسلسل على الشبكات الشق؛ 3) استخدام ‘حلقة عقد قسم’ وتجنب الخلط بين ترتيب مجموعات القسم؛ 4) استخدام ‘حلقة رفع مستوى سطح الماء’ وتأكد من المقاطع متوضعة في قمة المياه وأن اتصال الشبكة أولاً، بغية وضعها في الموضع المطلوب في الشبكات؛ 5) استخدام الفيلم الدعم على رف ألمنيوم وجعله أسهل لاسترداد الأقسام المتعلقة بالشبكات وتجنب التجاعيد الفيلم الدعم؛ و 6) استخدام أنبوب المصبوغة وتجنب كسر دعم الأفلام بطريق الخطأ مع ملاقط. هذا الأسلوب الجديد من الحصول على المقاطع سامسونج المسلسل دون صعوبة. الأسلوب الذي يجعل من الممكن لتحليل الهياكل الخلية من الكائنات الحية الدقيقة بدقة عالية في ثلاثي الأبعاد، والذي لا يمكن تحقيقه باستخدام أسلوب أولتراميكروتومي جمع الأشرطة التلقائية والوجه كتلة المسلسل أو تركيز أيون شعاع المسح الضوئي المجهر الإلكتروني.
Introduction
الأسلوب تقطيع سامسونج المسلسل السليم أمر لا غنى عنه لدراسة الخلايا ومكونات الخلية ثريديمينسيونالي على المستوى المجهري الإلكترون. لدينا دراسة ديناميات المغزل القطب الهيئة في دورة خلية من خلايا الخميرة، وكشفت عن التغييرات الشكلية لهذه أولتراستروكتوري خلال دورة الخلية والوقت من الازدواجية1،2،3، 4،5. في عام 2006، ونحن صاغ كلمة جديدة ‘ستروكتومي’ عن طريق الجمع بين ‘هيكل’ و ‘-ome’، ويعرف أنه 6،‘معلومات كمية وثلاثي الأبعاد الهيكلية خلية كاملة على المستوى المجهري الإلكترون’7.
تحليل ستروكتومي، الأمر الذي يتطلب تقنية تقطيع سامسونج المسلسل، وجد أن خلية خميرة Saccharomyces cerevisiae و اكسوفيالا ديرماتيتيديس ريبوسوم 200,000 حوالي7،8، الإشريكيّة القولونية خلية 26,000 ريبوسوم9، خلية بكتريا السل قد 1,700 ريبوسوم10 والبكتيريا اللولبية ميوجن ريبوسوم فقط 30011. تعتبر هذه المعلومات مفيدة في تقدير معدل النمو في كل كائن حي، ولكن أيضا في تحديد الأنواع9ليس فقط.
تحليل ستروكتومي علاوة على ذلك، أدت إلى اكتشاف كائن جديد؛ تم العثور على ميوجينينسيس باراكاريون في أعماق البحار قبالة ساحل اليابان، هيكل الخلية التي كانت وسيطة بين أولئك من بدائيات النوى وحقيقيات النوى12،13،،من1415. في الوقت الحاضر، تعتبر تقنية تقطيع سامسونج المسلسل يكون من الصعب أنه سيستغرق وقتاً طويلاً لإتقان. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير أسلوب موثوق فيه أي شخص يمكن أن تؤدي إلى تمزيقها سامسونج المسلسل دون صعوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب الأسلوب الذي قدم هنا لا معدات غالية الثمن. أنه يتطلب فقط رف ألومنيوم (الشكل 3) وشق ثلاث شبكات (الشكل 6 ج) وقسم-عقد الحلقات (الشكل 10a)، وحلقة رفع مستوى سطح الماء (الشكل 11 ألف) وأنبوب المصبوغة (الشكل 13). وهناك ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر بإخﻻص كيتا شيجييو على اقتراحات قيمة ومناقشة. ونشكر أيضا جون واكستين Sumire للقراءة الحرجة من المخطوطة.
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
