Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión
Summary
Este estudio presenta procedimientos confiables y fáciles para la obtención de secciones ultrafinas seriales de un microorganismo sin equipo costoso en microscopía electrónica de transmisión.
Abstract
Observación de células y componentes de la célula en tres dimensiones en el gran aumento en microscopía electrónica de transmisión requiere la preparación de secciones ultrafinas seriales de la muestra. Aunque la preparación de secciones ultrafinas seriales es considerado como muy difícil, es bastante fácil si se utiliza el método apropiado. En este documento, se muestra un procedimiento paso a paso para la obtención segura de las secciones ultrafinas seriales de microorganismos. Los puntos claves de este método son: 1) a utilizar gran parte de la muestra y ajustar el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que sean paralelas entre sí; 2) para cortar secciones seriales en grupos y evitar dificultades en la separación de las secciones con un par de mechones de pelo al recuperar un grupo de secciones seriadas en las rejillas de ranura; 3) usar un ‘lazo de retención de sección’ y evitar mezclar el orden de los grupos de sección; 4) para utilizar un bucle de aumento de superficie de agua y asegúrese de que las secciones se colocan en el ápice del agua y que tocan la red en primer lugar, con el fin de colocarlos en la posición deseada sobre las rejillas; 5) para utilizar la película de soporte en un bastidor de aluminio y que sea más fácil recuperar las secciones en las rejillas y evitar el arrugamiento de la película de soporte; y 6) a utilizar un tubo de coloración y evitar romper accidentalmente las películas de soporte con las pinzas. Este nuevo método permite obtener secciones seriadas ultrafinas sin dificultad. El método permite analizar las estructuras celulares de los microorganismos en alta resolución en 3D, que no puede lograrse mediante el método automático de recogida de cinta ultramicrótomo y serie bloque-cara o viga de ion enfocada microscopía electrónica de barrido.
Introduction
Técnica de seccionamiento ultrafina serie adecuada es indispensable para el estudio de las células y los componentes de la célula tridimensionalmente en el nivel microscópico de electrones. Hemos estudiado la dinámica del cuerpo de polo del huso en el ciclo celular de las células de levadura y reveló cambios morfológicos de su ultraestructura durante el ciclo celular y el tiempo de duplicación1,2,3, 4,5. En 2006, acuñó una nueva palabra ‘structome’ mediante la combinación de ‘estructura’ y ‘-ome’ y se define como la ‘información cuantitativa y tridimensional estructural de una célula entera en el nivel microscópico de electrones’ 6,7.
Por el análisis de structome, que requiere técnica de seccionamiento ultrafino serial, se encontró que una célula de levadura de Saccharomyces cerevisiae y Exophiala dermatitidis tenía unos 200.000 ribosomas7,8, un Escherichia coli celular tenía 26.000 ribosomas9, un celular de la Mycobacterium tuberculosis tenía 1.700 ribosomas10 y bacterias en espiral Myojin tenían los ribosomas sólo 30011. Esta información es útil en la estimación no solo de la tasa de crecimiento en cada organismo, pero también en la identificación de especies9.
Además, structome análisis conducido al descubrimiento de un nuevo organismo; Parakaryon myojinensis fue encontrado en el mar frente a las costa de Japón, cuya estructura de la célula fueron un intermedio entre los de procariotas y eucariotas,12,13,14,15. En la actualidad, serie técnica de seccionamiento ultrafino se considera tan difícil que tomaría mucho tiempo al maestro. En este estudio, hemos desarrollado un método fiable en la que cualquiera puede realizar seccionamiento ultrafino serial sin dificultad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado aquí no requiere de costoso equipo. Requiere sólo un bastidor de aluminio (figura 3), hendidura de tres rejillas (figura 6 c), sección explotación bucles (figura 10a), lazo de aumento de superficie de agua (figura 11a) y un tubo de tinción (figura 13). Hay muchas características del método actual. Gran parte de la muestra se utiliza para ajustar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos sinceramente a Shigeo Kita por sus valiosas sugerencias y discusión. También agradecemos a John y Sumire Eckstein para su lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
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