Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie
Summary
Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.
Abstract
Beobachtung von Zellen und Zellbestandteile in drei Dimensionen bei hoher Vergrößerung im Transmissions-Elektronenmikroskopie erfordert Vorbereitung ultradünne Schnittserien der Probe. Obwohl Vorbereitung ultradünne Schnittserien gilt als sehr schwierig sein, ist es ziemlich einfach, wenn die richtige Methode verwendet wird. In diesem Beitrag zeigen wir eine schrittweise Anleitung für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen sicher. Die wichtigsten Punkte dieser Methode sind: 1) verwenden Sie den großen Teil der Probe und Probe Oberfläche und Messer Rand anpassen, so dass sie parallel zueinander; (2) zu schneiden Schnittserien in Gruppen und vermeiden Schwierigkeiten beim trennen Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden; (3) zu verwenden, eine “Abschnitt-Holding-Schleife” und zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen; (4), verwenden Sie eine Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife, und stellen Sie sicher die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren; (5), verwenden Sie die Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell und machen es einfacher, die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, von der Trägerfolie Faltenbildung; und 6) verwenden Sie eine Färbung zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette. Diese neue Methode ermöglicht ultradünne Schnittserien ohne Schwierigkeiten. Die Methode ermöglicht die Zellstrukturen von Mikroorganismen mit hoher Auflösung in 3D, zu analysieren, die nicht mithilfe der automatischen Band sammeln regungsloses Methode und serielle Block-Gesicht oder fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie erreicht werden kann.
Introduction
Richtige ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik ist unerlässlich, um Zellen und Zellbestandteile dreidimensional auf mikroskopischer Ebene Elektron zu studieren. Wir haben untersucht die Dynamik der Spindel Pol Körper im Zellzyklus von Hefezellen und offenbart morphologische Veränderungen ihrer Ultrastruktur während des Zellzyklus und die Zeit von Doppelarbeit1,2,3, 4,5. Im Jahr 2006 haben wir ein neues Wort “Structome” durch die Kombination von “Struktur” geprägt und “-Ome”, und als die ‘quantitative und dreidimensionalen Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf mikroskopischer Ebene Elektron’ 6,7definiert.
Durch eine Structome Analyse, die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik erfordert, wurde festgestellt, dass eine Hefezelle von Saccharomyces Cerevisiae und Exophiala Dermatitidis etwa 200.000 Ribosomen7,8, ein hatte Escherichia coli Zelle 26.000 Ribosomen9, Mycobacterium Tuberculosis Zelle hatte 1.700 Ribosomen10 und Myojin Spirale Bakterien hatten nur 300 Ribosomen11. Diese Informationen sind hilfreich bei der Abschätzung der nicht nur der Wachstumsrate in jedem Organismus, sondern auch bei der Identifizierung von Arten9.
Darüber hinaus Structome Analyse führte zu die Entdeckung eines neuen Organismus; Parakaryon Myojinensis fand in der Tiefsee vor der Küste Japans, deren Zellstruktur waren ein Zwischenprodukt zwischen denen der Prokaryoten und Eukaryoten12,13,14,15. Derzeit gilt die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik so schwer sein, dass es lange, zu meistern dauern würde. In dieser Studie haben wir eine zuverlässige Methode entwickelt, in der jemand serielle ultradünnen Schneiden problemlos durchführen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Methode erfordert keine teure Ausrüstung. Es erfordert nur ein Alu-Rack (Abbildung 3), 3-Schlitz-Raster (Abbildung 6 c), Abschnitt-Holding Schleifen (Abb. 10a), Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife (Abbildung 11a) und eine Färbung Rohr (Abbildung 13). Es gibt viele Features des vorliegenden Verfahrens. Der große Teil der Probe wird verwendet, um die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken herzlichst Shigeo Kita für seine wertvollen Anregungen und Diskussionen. Wir danken auch John und Sumire Eckstein für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
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