Метод для получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов в просвечивающей электронной микроскопии
Summary
Это исследование представляет надежный и простой процедуры получения последовательного ультратонких секции микроорганизмов без дорогостоящего оборудования в просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Наблюдения клеток и клеточных компонентов в трех измерениях с высоким увеличением в просвечивающей электронной микроскопии требует подготовки серийный ультратонких секции образца. Хотя подготовка серийный ультратонких секции считается очень сложно, это довольно легко, если используется правильный метод. В этой статье мы покажем пошаговые процедуры для безопасного получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов. Ключевые моменты этого метода являются: 1) чтобы использовать большую часть образца и отрегулировать краю образца поверхности и нож, так что они параллельны друг другу; 2) для резки серийный секции в группах и избежать трудностей в отделять разделы, используя пару пряди волос при извлечении группа последовательных секций на щели сетки; 3) использовать петлю раздел Холдинг и избегать смешивания порядок групп разделов; 4) чтобы использовать поверхность водоподъёмного цикл и убедитесь, что разделы располагаются на вершине воды и что они touch сетки во-первых, чтобы поместить их в нужное положение на сетках; 5) использовать поддержку фильма на алюминиевой стойке и сделать его легче восстановить разделы сетки и избежать складок фильма поддержки; и 6) использовать трубу окрашивание и избежать случайного нарушения поддержки фильмов с помощью пинцета. Этот новый метод позволяет получить серийный ультратонких разделы без затруднений. Этот метод делает возможным для анализа структуры клетки микроорганизмов с высоким разрешением в формате 3D, который не может быть достигнуто с помощью автоматического сбора ленты ultramicrotome метода и последовательный блок лицо или сфокусированные ионные пучка сканирующая электронная микроскопия.
Introduction
Надлежащего последовательного ультратонких секущей техника является необходимым для изучения клеток и клеточных компонентов трехмерно на микроскопическом уровне электрона. Мы изучили динамику шпинделя полюс тела в клеточный цикл дрожжевых клеток и выявили морфологические изменения их ультраструктуру во время дублирования1,2,3, и клеточный цикл 4,5. В 2006, мы придумали новое слово «structome» путем объединения «структура» и ‘-ome’ и определил его как «количественные и трехмерных структурная информация всей ячейки на микроскопическом уровне электрон» 6,7.
Structome анализ, который требует последовательного ультратонких секущей технику, было установлено, что клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Exophiala dermatitidis было около 200.000 рибосомы7,8, Кишечная палочка клеток имели 26000 рибосомы9, микобактерии ячейки 1700 рибосомы10 и Мёдзин спираль бактерий было только 300 рибосомы11. Эта информация полезна не только оценки темпов роста в каждом организме, но и в идентификации видов9.
Кроме того анализ structome, привело к открытию нового организма; Parakaryon myojinensis был найден в глубокое море у побережья Японии, чьи клеточной структуры были промежуточным между теми прокариот и эукариот12,13,14,15. В настоящее время серийный ультратонких секущей техника считается так трудно, что он примет долгое время освоить. В этом исследовании мы разработали надежный метод, в котором кто-нибудь может выполнять последовательный ультратонких секционирование без затруднений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленные здесь метод требует не дорогое оборудование. Он требует только алюминиевые стойки (рис. 3), три щелевой сетки (рис. 6 c), раздел Холдинг петли (Рисунок 10А), поверхность водоподъёмного петлю (рис. 11А) и окрашивани?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы искренне благодарим Шигео Kita за его ценные предложения и обсуждения. Мы также благодарим Джон и Sumire Eckstein за их критического чтения рукописи.
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
