Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione
Summary
Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.
Abstract
Osservazione di cellule e componenti delle cellule in tre dimensioni ad alto ingrandimento in microscopia elettronica di trasmissione richiede la preparazione di sezioni ultrasottili di serie dell’esemplare. Anche se la preparazione di sezioni ultrasottili seriale è considerato essere molto difficile, è piuttosto facile se viene utilizzato il metodo corretto. In questa carta, indichiamo una procedura dettagliata per ottenere in modo sicuro seriale sezioni ultrasottili di microrganismi. I punti chiave di questo metodo sono: 1) per utilizzare la gran parte dell’esemplare e regolare il bordo di superficie e coltello di esemplare affinché siano paralleli tra loro; 2) per tagliare le sezioni di serie in gruppi ed evitare difficoltà di separare sezioni usando un paio di ciocche di capelli durante il recupero di un gruppo di sezioni di serie sulle griglie a fessura; 3) utilizzare un ‘sezione-holding loop’ e evitare di confondere l’ordine dei gruppi di sezione; 4) per utilizzare un ciclo di acqua di superficie-sensibilizzazione e assicurarsi che le sezioni siano posizionate all’apice dell’acqua e che toccano la griglia in primo luogo, al fine di metterli nella posizione desiderata sulle griglie; 5) per utilizzare il film di supporto su un rack di alluminio e rendere più facile per recuperare le sezioni sulle griglie ed evitare grinze della pellicola supporto; e 6) utilizzare un tubo di colorazione ed evitare accidentalmente rompere il film di supporto con le pinzette. Questo nuovo metodo permette di ottenere sezioni ultrasottili seriale senza difficoltà. Il metodo permette di analizzare la struttura cellulare dei microrganismi ad alta risoluzione in 3D, che non può essere realizzato utilizzando il metodo ultramicrotomo raccolta nastro automatico e blocco-faccia seriale o fascio ionico focalizzato, microscopia elettronica a scansione.
Introduction
Tecnica di sezionamento ultrasottile seriale corretta è indispensabile per lo studio di cellule e componenti cellulari tridimensionalmente a livello microscopico dell’elettrone. Abbiamo studiato la dinamica del corpo del mandrino palo nel ciclo cellulare delle cellule di lievito e ha rivelato i cambiamenti morfologici delle loro ultrastruttura durante il ciclo cellulare ed il tempo di duplicazione1,2,3, 4,5. Nel 2006, abbiamo coniato una nuova parola ‘structome’ combinando ‘struttura’ e ‘-ome’ e l’ha definita il ‘informazioni strutturali quantitative e tridimensionale di una cella intera a livello microscopico dell’elettrone’ 6,7.
Dall’analisi di structome, che richiede tecnica seriale di sezionamento ultrasottile, si è constatato che una cellula di lievito Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis ha circa 200.000 ribosomi7,8, un Escherichia coli cella aveva 26.000 ribosomi9, una cella di tubercolosi del micobatterio avuto 1.700 ribosomi10 e batteri a spirale Myojin avevano solo 300 ribosomi11. Queste informazioni sono utili nella stima non solo il tasso di crescita in ogni organismo, ma anche nell’identificazione di specie9.
Inoltre, analisi di structome ha portato alla scoperta di un nuovo organismo; Parakaryon myojinensis è stato trovato nel mare profondo al largo delle coste del Giappone, la cui struttura di cella erano un intermedio tra quelli dei procarioti e negli eucarioti12,13,14,15. Allo stato attuale, tecnica di sezionamento ultrasottile seriale è considerato essere così difficile che ci vorrebbe molto tempo per master. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile in cui chiunque può eseguire il sezionamento seriale ultrasottile senza difficoltà.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentato non richiede costose attrezzature. Richiede solo un rack di alluminio (Figura 3), tre-fessura griglie (Figura 6C), tenuta di sezione loop (Figura 10a), acqua di superficie-sensibilizzazione loop (Figura 11a) e un tubo di colorazione (Figura 13). Ci sono molte caratteristiche del presente metodo. La gran parte del campione viene utilizzata per regola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo sinceramente Shigeo Kita per i suoi preziosi suggerimenti e discussione. Ringraziamo anche John e Sumire Eckstein per loro lettura critica del manoscritto.
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
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