Een methode voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van micro-organismen in transmissie-elektronenmicroscopie
Summary
Deze studie geeft betrouwbare en eenvoudige procedures voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van een micro-organisme zonder dure apparatuur in transmissie-elektronenmicroscopie.
Abstract
Observeren van cellen en celbestanddelen in drie dimensies bij hoge vergroting in transmissie-elektronenmicroscopie vereist voorbereiding van seriële uiterst dunne secties van het specimen. Hoewel de voorbereiding van seriële uiterst dunne secties wordt beschouwd als moeilijk, is het vrij eenvoudig als de juiste methode wordt gebruikt. In deze paper tonen we een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen van veilig seriële uiterst dunne secties van micro-organismen. De belangrijkste punten van deze methode zijn: 1) het grote deel van het model gebruiken en aanpassen van het specimen oppervlak en mes-rand zodat zij parallel aan elkaar; 2) te snijden seriële secties in groepen en voorkomen van problemen bij het scheiden van de secties met behulp van een paar haarlokken bij het ophalen van een groep van seriële secties op de gleuf rasters; 3) gebruik van een ‘sectie-bedrijf loop’ en niet te vermengen met de volgorde van de sectiegroepen; 4) te gebruiken van een ‘Water-oppervlak-raising loop’ en zorg ervoor dat de secties zijn geplaatst op de top van het water en dat ze het raster eerst, aanraken om hen in de gewenste positie op de roosters; 5) gebruiken de ondersteuning film op een aluminium rek en gemakkelijker om te herstellen van de secties op de rasters en om te voorkomen dat kreuken van de film van de steun; en 6) gebruik van een kleuring buis te voorkomen dat per ongeluk breken de steun films met een pincet. Deze nieuwe methode kan verkrijgen van seriële uiterst dunne secties zonder problemen. De methode maakt het mogelijk om te analyseren cel structuren van micro-organismen op hoge resolutie in 3D, dat niet kan worden bereikt met behulp van de automatische tape-verzamelen ultramicrotome methode en seriële blok-gezicht of gerichte ion beam scanning elektronen microscopie.
Introduction
Juiste seriële uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden techniek is onmisbaar voor het bestuderen van de cellen en celbestanddelen ruimtelijk op microscopisch niveau elektron. We hebben onderzocht de dynamiek van de spindel pole lichaam in de celcyclus van gistcellen, en morfologische veranderingen van hun ultrastructuur onthuld tijdens de celcyclus en de tijd voor dubbel1,2,3, 4,5. In 2006 bedacht we een nieuw woord ‘structome’ door het combineren van ‘structuur’ en ‘-ome’, en het verstaan van de “kwantitatieve en drie-dimensionale structurele informatie van een hele cel op microscopisch niveau elektron” 6,7.
Door structome analyse, waarvoor seriële uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden techniek, bleek dat een gistcel Saccharomyces cerevisiae en Exophiala dermatitidis had ongeveer 200.000 ribosomen7,8, een Escherichia coli cel had 26.000 ribosomen9, een Mycobacterium tuberculosis cel had 1.700 ribosomen10 en Myojin spiraal bacteriën had slechts 300 ribosomen11. Deze informatie is nuttig bij het schatten van niet alleen het groeitempo op jaarbasis in elk organisme, maar ook in de identificatie van soorten9.
Verder structome analyse leidde tot de ontdekking van een nieuwe organisme; Parakaryon myojinensis werd gevonden in de diepe zee voor de kust van Japan, waarvan celstructuur waren een intermediair tussen die van prokaryoten en eukaryoten,12,13,14,15. Op dit moment seriële uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden techniek wordt beschouwd als zo moeilijk dat het lang om te overmeesteren duren zou. In deze studie hebben we een betrouwbare methode waarin iemand kunt uitvoeren seriële uiterst dunne afdelen zonder problemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier voorgestelde methode vereist geen dure apparatuur. Het vereist alleen een aluminium rack (Figuur 3), drie-gleuf rasters (Figuur 6 c), sectie-bedrijf lussen (figuur 10a), water-oppervlak-raising lus (Figuur 11), en een kleuring buis (Figuur 13). Er zijn vele functies van de huidige methode. Het grote deel van het model wordt gebruikt om de model-oppervlak en mes-rand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken oprecht Shigeo Kita voor zijn waardevolle suggesties en discussie. We ook bedanken John en Sumire Eckstein voor hun kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
