Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission
Summary
Cette étude présente des procédures fiables et faciles pour obtenir des coupes sériées ultraminces d’un micro-organisme sans matériel coûteux en microscopie électronique à transmission.
Abstract
Observer les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à fort grossissement en microscopie électronique à transmission nécessite préparation ultraminces sériées du spécimen. Bien que la préparation des coupes sériées ultraminces est considéré comme très difficile, il est assez facile si on utilise la méthode appropriée. Dans cet article, nous montrons une procédure étape par étape pour obtenir en toute sécurité séries ultraminces de micro-organismes. Les points essentiels de cette méthode sont : 1) d’utiliser une partie importante de l’échantillon et ajuster les bords de surface et couteau de spécimen afin qu’ils soient parallèles entre eux ; 2) de la coupe des coupes sériées dans les groupes et éviter des difficultés à séparer les sections à l’aide d’une paire de mèches de cheveux lors de la récupération d’un groupe de coupes sériées sur les grilles de la fente ; 3) à utiliser une « boucle de Section-holding » et éviter de mélanger l’ordre des groupes de section ; 4) à utiliser une « boucle de l’eau de surface-sensibilisation » et s’assurer que les sections sont positionnées sur l’apex de l’eau et qu’ils touchent la grille en premier lieu, afin de les mettre dans la position désirée sur les grilles ; 5) d’utiliser le film support sur un rack en aluminium et rendre plus facile de récupérer les sections sur les grilles et pour éviter les plis du film soutien ; et 6) à utiliser un tube de coloration et d’éviter de casser accidentellement les films de soutien avec des pincettes. Cette nouvelle méthode permet d’obtenir des coupes sériées ultraminces sans difficulté. La méthode permet d’analyser les structures cellulaires des microorganismes à haute résolution en 3D, qui ne peut être atteint en utilisant la méthode d’ultramicrotome collecte ruban automatique et la série îlot ou le faisceau ionique focalisé, microscopie électronique à balayage.
Introduction
Technique de sectionnement ultramince série appropriée est indispensable pour étudier les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à l’échelle microscopique de l’électron. Nous avons étudié la dynamique du corps polaire du fuseau dans le cycle cellulaire des cellules de levure et révèle des changements morphologiques de leur ultrastructure au cours du cycle cellulaire et l’heure de répétition1,2,3, 4,,5. En 2006, nous avons inventé un nouveau mot « structome » en combinant la « structure » et ‘-ome’ et défini comme le « informations structurelles quantitatives et en trois dimensions d’une cellule entière à l’échelle microscopique de l’électron » 6,7.
Par l’analyse structome, qui requiert la technique sérielle de sectionnement ultramince, il a été constaté qu’une cellule de levure de Saccharomyces cerevisiae et Exophiala dermatitidis avait environ 200 000 ribosomes7,8, un Escherichia coli cellule avait 26 000 ribosomes9, une cellule de Mycobacterium tuberculosis a 1 700 ribosomes10 et Myojin spirale bactéries avaient seulement 300 ribosomes11. Cette information est utile pour évaluer non seulement le taux de croissance dans chaque organisme, mais aussi dans l’identification des espèces9.
En outre, structome analyse conduit à la découverte d’un nouvel organisme ; Parakaryon myojinensis a été trouvé dans l’eaux profondes au large des côtes du Japon, dont la structure cellulaire étaient intermédiaires entre ceux des procaryotes et des eucaryotes12,13,14,15. À l’heure actuelle, série technique sectionnement ultramince est considérée comme si difficile qu’il faudrait beaucoup de temps à maîtriser. Dans cette étude, nous avons développé une méthode fiable dans lequel n’importe qui peut effectuer des coupes ultraminces série sans difficulté.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici ne nécessite aucun équipement coûteux. Il nécessite seulement un rack en aluminium (Figure 3), trois-fente grilles (Figure 6C), section porte-boucles (Figure 10 a), eau de surface-sensibilisation boucle (Figure 11 a) et un tube de coloration (Figure 13). Il y a plusieurs caractéristiques de la méthode actuelle. La grande partie de l’écha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions sincèrement Shigeo Kita pour ses précieuses suggestions et discussion. Nous remercions également John et Sumire Eckstein pour leur lecture critique du manuscrit.
Materials
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | – | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | – | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | – | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | – | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | – | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | – | Transmission electron microscope |
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