ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

すべての実験 ARVO ステートメントに従って眼科と視覚に関する研究における動物の使用を行ったし、地元当局によって承認されたします。 1 シリコンウェハー上超薄切片の作製 サンプル固定 0.1% グルタルアルデヒド、4% のホルムアルデヒド 0.1 M cacodylate バッファーを含む固定液を準備します。 。 注: 注意!グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、cacodylate バッファーを操作するときに注意を使用して、適切な個人用保護具を着用、発煙のフードで動作します。 上記 15 (5 dpf) ゼブラフィッシュ幼虫 (エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸、PBS (リン酸バッファー生理食塩水、pH 7) で 0.4 %w/v) tricaine 安楽死させる 5 日後に受精します。 は、氷の上あらかじめ冷やして固定液に浸漬して幼虫を修正します。ヘッドを外すし、穏やかな揺動 4 ° C で一晩インキュベートします。 は、1% のアガロース層状の板に冷固定液で微細鉗子と (双眼鏡) の下で顕微解剖メスを使用して目の周りの組織をトリミングすることによって目を解剖します。新鮮な中古冷蔵定着剤を管に目を転送します。 室温 (RT) で洗うたび PBS (リン酸バッファー生理食塩水、pH 7.4) 5 分で 2 回洗う。 ゼラチン浸潤およびマウント ウォーム アップ 15 mL 食ブランド ゼラチン 12 %w/v PB (リン酸バッファー, 0.1 M pH 7.4) で 40 ° C、PBS を削除し、目を含むチューブにゼラチン溶液を追加。サンプル ゼラチン浸潤を確認し穏やかな揺れでサーモや水浴の 40 ° C で 10-30 分間インキュベート優しくチューブをタップします。 を埋める 12 mm × 5 × 3 mm のシリコンやポリエチレン 40 ° C の水浴中温かいゼラチンと金型を埋め込みフラット。ピペットを使用して金型ごと 2 つ目を追加、解剖針を用いた両眼の下でそれらを正しく整列させるし、1 分間室温でクールダウンし、4 ° C、20 分で硬化ゼラチン ゼラチン ブロックのかみそりの刃を使用してブロックごとの 1 つの目に合わせて両眼下を再トリムします。 は、氷の上 PB で 2.3 M ショ糖に埋め込まれたゼラチン目を転送します。4 ° C で一晩インキュベートします。 新しい 2.3 M ショ糖液と 4 ° C または-20 ° C で保存場所に Exchange この手順の後のサンプルは区分のため準備ができているまたはヶ月に数週間の-20 ° C で保存することができます。 は再クライオ端子に転送する前にゼラチン ブロック目のほとんどのサイズをトリミングします。液体窒素で低温ウルトラミクロトームに乗り換えで凍結します。 Cryosectioning カット 110 nm 厚いセクション-120 ° c 低温ウルトラミクロトームでダイヤモンド ナイフを使用します。 (水) で 2% セルロースと 2.3 M ショ糖液 (1:1) の液滴を含む有線ループ セクションを選ぶ。7 mm × 7 mm シリコン ・ ウエハにセクションを転送します。さらに処理まで 4 ° c のセクションを格納します。 2。Immunolabelling 4 滴滴に逆さまでウエハを置くことによって 20 分の 0 の ° C で PBS で洗浄ウェーハ。PBS 2 x 2 分間室温で洗って。 1 分の pbs は、0.15% で 3 回 加温グリシン。1 分の 3 x を洗う/PBS で洗浄します。5 分前 incubate PBG (0.5% ウシ血清アルブミン BSA と 0.2% ゼラチン タイプ B PBS) と ウサギ抗 Tom20 と加温 (材料表 参照) PBG の (4 μ g/mL) 室温で 30 分間。 は、PBG で 6 x 1 分/洗浄を洗浄します。あらかじめ抗家兎 Alexa 647 F(ab') 2 とした加温で 5 分間 PBG を incubate (材料の表 を参照してください) PBG の (7.5 μ g/mL) 30 分 は、PBG で 6 x 1 分/洗浄を洗浄します。3 x 2 分を PBS で洗浄します。DAPI を孵化させなさい (4 μ g/mL) 10 の PBS で s 洗浄の PBS で 2 x 2 分。 3。超解像顕微鏡 加温簡潔にウェハ (10 s) グリセロール (80%) の 1:1 溶液液滴上に配置し、清掃システム (200 mM リン酸緩衝 10% ブドウ糖、0.5 mg/mL を含む酸素を格納するバッファーを画像でglucoseoxidase、40 μ g/mL カタラーゼ、15 mM ベータ-mercaptoethylamine 塩酸塩 (MEA HCL)、pH 8.0). グリセロール (80%) の 1:1 混合物の新鮮なドロップにガラス下部 (厚さ 170 ± 5 μ m) シャーレにウエハース (下向きのセクション) を転送し、(ステップ 3.1) のようにバッファーをイメージングします。 は、ピペットで、すべての側面からウェハの下に液体のほとんどを削除します。シリコーンのストライプを使用してペトリ皿の底にウェーハを修正します 。 注: シリコン ストライプ 2 成分シリコーン接着剤 (3 mm × 12 mm) から作られています。 高い開口数を使用して倒立顕微鏡上の イメージ セクション (例: 160 X/NA 1.43; 材料表 を参照ください) 油浸超解像専用対物レンズ。イメージング、前に横方向と軸のドリフトを最小限に抑える/減らすために顕微鏡の温度に釣り合うサンプルができます。 センターの関心のある分野、最初広視野落射蛍光画像を取得します。超解像の操作モードに変更します。15 ms にカメラの露光時間を調整し、(EM) 300 の最大利得を掛けて電子を設定します。 点灯サンプル、642 nm 連続波レーザー落射蛍光モードで最大のレーザー パワー (~2.8 kW/cm 2 に対応)。よく、確率が低い場合の個々 の信号が重なって、レーザー パワーを ~0.7 kW/cm 2 にセットして、単一分子が点滅するとすぐに、各フレームで区切られます。30,000 フレームの最小値を取得することにより、落射蛍光モードで raw 画像を記録します 。 注: すべてのこれらのパラメーターことができますのによって異なる異なる標本密度をラベリングします。 Raw データから復興イベント リスト (raw イメージで各単一分子の点滅のローカライゼーション) を生成する] をクリックして 30 光子 (サンプルに応じて調整する必要がある) の検出閾値を使用して " 評価 " で、' t シリーズ解析 ' 下 ' ツール '. ガウシアンフィッティング 16 4 の描画ピクセル サイズを適用することによって超解像画像を視覚化するをクリックして nm " イメージの作成 " の ' イベント リスト処理パネル ' 下 ' ツール ' 。 注: 超解決イメージを生成するため本研究で使用されるシステムの統合ソフトウェア ・ ツールが採用されました。しかし、他の単一分子局在ベース システムで記述されている超解像イメージングを実行でした、雷雨 17 としてオープン ソース ソフトウェア ツールでデータを処理する可能性があります。 4。プラチナ シャドーイング シリコン ストライプを削除し、ウェハの縁近くにシャーレからそれを持ち上げるの PBS のドロップを追加します。5 分 2 分の 2 倍を洗う/PBS で洗浄ポストは、PBS で 0.1% グルタルアルデヒドでそれを修正し、ウェハの pbs は、2 x 2 分を洗うです。 では、5 分/インキュベーション セルロース 2% 氷の上の水の 1 滴のために二度ウェーハを孵化させなさい。遠心管のウェハを挿入し、遠心分離機 14,100 x g で 90 s. マウントそれカーボン セメントの実施と SEM アルミ スタブにします。 2 から 10 までのレイヤーを追加するプラチナ/電子 8 ° 回転シャド ウイングによる試料の炭素の nm ビーム蒸発デバイス設定: 1.55 kV、55 mA、0.3 nm/秒、8 °、回転レベル 4 の角度。 5。走査電子顕微鏡観察 スキャン イメージ セクション電子 m1.5 icroscope kV、2 mm 作業距離し、二次電子検出器のレンズと共にします。 6。光および電子顕微鏡画像の配置 フィジー 18 をクリックして画像の 両方オープン タイプ " ファイル |オープン "。クリックしてキャンバスのサイズを調整する " 画像 |調整 |キャンバス サイズ " をクリックしてスタックに両方の画像をもたらすと " の画像 |スタック |画像のスタックを "。Tiff ファイル タイプとしてスタックを保存します。 、フィジーをクリックして新しい TrackEM2 19 インターフェイスを開く " ファイル | 新規 |TrackEM2 (新) "。黒のウィンドウを右クリックしを選択することによって両方の画像とスタックをインポート " インポート スタック ". 画像をマウスの右クリックを使用して選択しランドマークと手動で電子顕微鏡画像に 配置光顕微鏡画像 " 配置 |ランドマークと手動でレイヤーを揃える "。 ランドマークを追加する ピック選択ツール (黒矢印)。(補足図 1) 両方の画像で同じエッジを選択するのに参照として核の形状を使用します。(最低限 3 つのポイントは選択する必要があります) いくつかのポイントを追加します。クリックすると、選択するマウスの右でアフィン モデルの位置合わせを適用 " 変換を適用する |アフィン モデル ". レイヤーの透明度を変更 (補足図 1 を参照)、配置の品質を評価する。