Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

todos los experimentos fueron realizados con arreglo a la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión y fueron aprobados por las autoridades locales. 1. preparación de secciones ultrafinas sobre obleas de silicio fijación de la muestra de preparar la solución fijadora que contiene 0.1% de glutaraldehído, formaldehído al 4% en buffer de cacodilato 0.1m. Nota: atención! Tenga cuidado al trabajar con glutaraldehído, el formaldehído y el cacodilato buffer, usar equipo de protección personal y trabajar en una campana de humos. Eutanasia 5 días post fertilización (5 PD) larvas de pez cebra con Metanosulfonato (Metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato, 0.4% p/v en PBS (tampón fosfato salino, pH 7)) como se describió anteriormente 15. Fijar las larvas por inmersión en solución de fijación previamente enfriado en hielo. Quitar la cabeza e incubar durante una noche a 4 ° C con oscilación suave. Diseccionar los ojos por recortar el tejido alrededor del ojo con finas pinzas y un bisturí de microdisección (debajo de un binocular) en solución fijadora enfriada en una placa de agarosa-camas de 1%. Transfiera los ojos a un tubo con fijador previamente refrigerado fresco. Lavar dos veces en PBS (tampón fosfato salino, pH 7.4) durante 5 minutos cada lavado a temperatura ambiente (RT). Infiltración de gelatina y montaje Warm up 15 mL comida local marca gelatina 12% w/v en PB (tampón fosfato, 0.1 M pH 7,4) a 40 ° C. retirar el PBS y añadir solución de gelatina en los tubos que contienen los ojos. Golpee el tubo suavemente para asegurar el gelatina infiltra la muestra e incubar por 10-30 min a 40 ° C en un termobloque con agitación suave o en baño de agua. Llenar 12 mm x 5 mm x 3 mm de silicona o polietileno plana empotrar moldes con gelatina caliente en un baño de agua de 40 ° C. Agregar dos ojos molde usando una pipeta, alinearlos correctamente bajo un binocular utilizando una aguja de disección y dejar que la gelatina enfríe a temperatura ambiente durante 1 min y endurecen a 4 ° C durante 20 min Volver a recortar el bloque de gelatina bajo los binoculares para caber un ojo por bloque, utilizando una cuchilla de afeitar. Transferir los ojos de gelatina encajado a 2,3 M de sacarosa en PB en el hielo. Incubar a 4 ° C durante la noche. Intercambio de nueva solución de sacarosa de 2,3 M y almacenar a 4 ° C o -20 ° C; después de este paso, las muestras están listas para seccionamiento o pueden almacenarse a-20 ° C durante varias semanas a meses. Volver a recortar el bloque de gelatina a casi del tamaño del ojo antes de transferir a un crio-pin. Congelación en nitrógeno líquido y la transferencia a un crio-ultramicrotomía. Cryosectioning corte 110 nm de espesor-secciones a-120 ° C con un cuchillo de diamante en el cryo-ultramicrotomía. Escoge las secciones con un lazo de conexión que contienen una gota de metilcelulosa al 2% (en agua) y solución de sacarosa de 2,3 M (1:1). Transferencia de secciones a una oblea de silicio de 7 x 7 mm. Almacenar las secciones de 4 ° C hasta el procesamiento más. 2. Immunolabelling obleas de lavado con PBS a 0 ° C por 20 min en cuatro gotas colocando boca abajo las obleas en las gotas. Lavado en PBS 2 x 2 min a temperatura ambiente. Incubar 3 veces en el 0,15% de glicina en PBS, durante 1 minuto. Lavar 3 veces durante 1 min/lavado con PBS. Pre-incubate con PBG (PBS con BSA albúmina de suero bovino de 0.5% y 0.2% gelatina tipo B) por 5 min Incubar con conejo anti-Tom20 (véase la Tabla de materiales) en PBG (4 μg/mL) durante 30 min a temperatura ambiente. Lave 6 x para 1 min/lavado en el PBG. Pre-incubate con PBG durante 5 minutos a RT. incubar con anti-conejo Alexa 647 F(ab') 2 (véase la Tabla de materiales) en PBG (7,5 μg/mL) durante 30 minutos Lave 6 x para 1 min/lavado en el PBG. Lavado 3 x 2 minutos en PBS. Incubar con DAPI (4 μg/mL) en PBS durante 10 s. lavado 2 x 2 minutos en PBS. 3. Microscopia de la estupendo-resolución incubar la oblea brevemente (10 s) colocando en una gota de una solución de 1:1 de glicerol (80%) y proyección de imagen tampón que contiene un oxígeno limpieza sistema (200 mM de tampón fosfato que contiene glucosa 10%, 0, 5 mg/mL glucoseoxidase, 40 la catalasa μg/mL, clorhidrato de beta-mercaptoethylamine de 15 mM (MEA HCL), pH 8.0). Transferir las obleas (sección hacia abajo) a un plato de Petri de vidrio inferior (grueso 170 ± 5 μm) en una dulce gota de la mezcla 1:1 de glicerol (80%) y buffer (como en el paso 3.1) la proyección de imagen. Eliminar de todos lados, con una pipeta, la mayor parte del líquido por debajo de la oblea. Utilizar bandas de silicona para fijar la oblea en el fondo de la caja Petri. Nota: Rayas de silicona están hechos de silicona-pegamento de dos componentes (3 x 12 mm). Secciones de de imagen en un microscopio invertido con una alta apertura numérica (por ejemplo 160 X / NA 1.43; véase la Tabla de materiales) objetivo dedicado de super resolución de inmersión de aceite. Antes de la proyección de imagen, que las muestras alcancen la temperatura de microscopio con el fin de minimizar/reducir la deriva lateral y axial. Centro de la zona de interés y adquirir imágenes de referencia de epifluorescencia widefield primera. Cambiar el modo de operación de super resolución. Ajustar el tiempo de exposición de la cámara a 15 ms y fijar el electrón multiplicando la ganancia (EM) a un máximo de 300. Muestra se iluminan con la 642 nm láser de onda continua a máxima energía (correspondiente a ~2.8 kW/cm 2) en el modo de epifluorescencia. Tan pronto como la molécula solo parpadea están bien separadas en cada fotograma, por lo que la probabilidad es baja, que las señales individuales se superponen, la potencia del láser a ~0.7 kW/cm 2. Grabar la imagen raw en modo de epifluorescencia mediante la adquisición de un mínimo de 30.000 marcos. Nota: Todos estos parámetros pueden variar dependiendo de diferentes muestras y etiquetado densidad. De los datos sin procesar, generar una lista de eventos de reconstrucción (localizaciones de cada molécula solo parpadeo en la imagen raw) con un umbral de detección de 30 fotones (tiene que ser ajustado según la muestra) haciendo clic en " evaluar " en la ' serie t Análisis de ' en ' herramientas de '. Visualizar la imagen de super resolución por ajuste gaussiano 16 aplicar un tamaño de píxel de representación de 4 nm haciendo clic en " crear imagen " en el ' panel de elaboración de lista de eventos ' en ' Tools. ' Nota: Las herramientas de software integrado del sistema utilizado en este estudio fueron empleadas para generar la imagen super resuelta. Sin embargo, la proyección de imagen de resolución super descrito podría realizarse en cualquier otro sistema de localización basado en la sola molécula, y podrían ser procesados los datos con herramientas de software de código abierto como tormenta 17. 4. Sombra de platino quitar rayas de silicio y añada una gota de PBS cerca de los bordes de la oblea a levante de la caja Petri. Lave la oblea min 2 x 2 en PBS, luego post arreglarlo con glutaraldehído 0.1% en PBS por 5 minutos Lave 2 x por 2 min/lavado en PBS. Incubar la oblea dos veces durante 5 min/incubación en 1 gota de metilcelulosa al 2% en agua con hielo. Inserte la oblea en un tubo de centrífuga y centrifugar a 14.100 g x 90 s. montaje en un trozo de aluminio de SEM con realización de cemento carbono. Añadir una capa de 2 a 10 nm de platino/carbón en la muestra de sombreado rotatorio en 8° con un electrón viga ajustes de dispositivo de evaporación: 1.55 kV, 55 mA, a 0,3 nm/s y un ángulo de 8°, nivel de rotación 4. 5. Microscopía electrónica de barrido las secciones de la imagen con un barrido electrón microscope 1,5 kV, 2 mm trabajando a distancia y con un lente detector de electrones secundarios. 6. Alineación de la luz y la microscopia electrónica imágenes abrir ambos tipos de imágenes con Fiji 18 haciendo clic en " archivo | Abierto ". Ajustar el tamaño del lienzo haciendo clic en " imagen | Ajustar | Tamaño de la lona " y ambas imágenes una pila haciendo clic en " imagen | Pilas | Imágenes de pila ". Guarde la pila como tipo de archivo tiff. En Fiji, abra una nueva interfaz de 19 TrackEM2 haciendo clic en " archivo | nuevo | TrackEM2 (nuevo) ". Importar la pila con dos imágenes haciendo clic derecho sobre la ventana negra y seleccionando " pila de importación ". Imagen de microscopía de luz Alinee a microscopia electrónica imagen manualmente con puntos de referencia utilizando un clic derecho del ratón sobre la imagen y seleccionando " Alinee | Alinear capas manualmente con puntos de referencia ". Herramienta de pick la selección (la flecha negra) para agregar puntos de interés. Utilice la forma de núcleos como referencia para seleccionar los bordes de la misma en las dos imágenes (figura 1 complementaria). Agregar varios puntos (mínimos tres puntos tienen que ser seleccionados). Aplique alineación con un modelo afín por derecho del ratón hacer clic y seleccionar " aplicar transformación | Modelo afín ". Cambiar la transparencia de la capa (ver figura 1 complementaria) para evaluar la calidad de la alineación.