Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

todos os experimentos foram realizados em conformidade com a instrução de ARVO para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisa e foram aprovados pelas autoridades locais. 1. preparação de seções ultra-finas de Wafers de silício fixação de amostra preparar a fixador solução contendo 0,1% de glutaraldeído, formaldeído de 4% em tampão de cacodylate de 0,1 M. Nota: cuidado! Tenha cuidado ao trabalhar com glutaraldeído, formaldeído e cacodylate buffer, usar equipamento de protecção adequado e trabalhar em uma coifa. Eutanásia em 5 dias pós-larvas fertilização (5 dpf) zebrafish com metanosulfonato (Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo, 0,4% p/v em PBS (tampão fosfato pH salino, 7)) como descrito anteriormente 15. Corrigir as larvas por imersão em solução de fixador pré-refrigerada no gelo. Retire a cabeça e incubar durante uma noite a 4 ° C, com balanço suave. Dissecar os olhos por aparar o tecido ao redor dos olhos, usando a pinça fina e um bisturi microdissection (sob um binóculo) em solução fixador refrigerada no prato com camas agarose 1%. Transfira os olhos para um tubo com fixador pre-refrigerado fresco. Lavar duas vezes em PBS (tampão fosfato pH salino, 7,4) por 5 min cada lavagem à temperatura ambiente (RT). Infiltração de gelatina e montagem aquecer 15ml comida local marca gelatina 12% p/v em PB (tampão fosfato, 0,1 M pH 7,4) a 40 ° C. Retire a PBS e adicionar a solução de gelatina para os tubos contendo os olhos. Toque o tubo delicadamente para garantir as infiltrações de gelatina a amostra e incubar por 10-30 min a 40 ° C em uma thermoblock com agitação suave ou em banho-maria. Preencher 12 x 5 x 3 mm silicone ou polietileno liso incorporação moldes com gelatina quente em um banho de água de 40 ° C. Adicionar dois olhos por molde utilizando uma pipeta, alinhá-las corretamente sob um binóculo usando uma agulha de dissecação e deixe a gelatina arrefecer à temperatura ambiente por 1 min e endurecer a 4 ° C por 20 min. Re-aparar o bloco de gelatina sob o binóculo para caber um olho por bloco usando uma lâmina de barbear. Transferir os olhos de gelatina incorporado para 2,3 M de sacarose em PB no gelo. Incubar durante uma noite a 4 ° C. Exchange nova solução de sacarose de 2,3 M e loja em 4 ° C ou a-20 ° C; após esta etapa, as amostras estão prontas para corte ou pode ser armazenadas a-20 ° C durante várias semanas a meses. Re-apare o bloco de gelatina para quase do tamanho do olho antes de transferir para um crio-pin. Congelamento em nitrogênio líquido e transferência para uma crio-ultramicrotome. Cryosectioning corte 110 nm de espessura-seções-120 ° c, com uma faca de diamante no cryo-ultramicrotome. Escolher as secções com um loop com fios contendo uma gota de metilcelulose 2% (em água) e solução de sacarose de 2,3 M (1:1). Transferi as seções de uma bolacha de silicone 7 x 7 mm. Armazenar as seções em 4 ° C até posterior processamento. 2. Encontrava bolachas de lavagem com PBS a 0 ° C por 20 min em quatro gotas colocando as bolachas de cabeça para baixo sobre as gotas. Lavagem em PBS 2 x 2 min à temperatura ambiente. Incubar 3 vezes em glicina de 0,15% em PBS, por 1 min cada. Lavar 3 x por 1 min/lavagem com PBS. Pre-incubate com PBG (PBS com BSA de albumina de soro bovino 0,5% e 0,2% gelatina tipo B) 5 min. Incubar com coelho anti-Tom20 (veja a Tabela de materiais) em PBG (4 µ g/mL) por 30 min à temperatura ambiente. Lavar 6 x 1 min/lavagem de PBG. Pre-incubate com PBG durante 5 min à RT. Incubar com Alexa 647 F(ab') de anti-coelho 2 (ver a Tabela de materiais) em PBG (7,5 µ g/mL) por 30 min. Lavar 6 x 1 min/lavagem de PBG. Lave 3 x 2 min em PBS. Incube com DAPI (4 µ g/mL) em PBS por 10 s. lavagem 2 x 2 min em PBS. 3. Microscopia de super-resolução incubar a bolacha brevemente (10 s) por colocá-lo em uma gota de uma solução de 1:1 do glicerol (80%) e imaging tampão contendo oxigênio eliminação sistema (200mm tampão fosfato contendo 10% de glicose, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 catalase µ g/mL, beta-mercaptoethylamine cloridrato de 15mm (MEA HCL), pH 8.0). Transferir as bolachas (seção voltada para baixo) para um prato de Petri vidro inferior (espessura 170 ± 5 µm) para uma gota fresca da mistura 1:1 do glicerol (80%) e imaging tampão (como na etapa 3.1). Remover de todos os lados, com uma pipeta, maior parte do líquido por baixo a bolacha. Use listras do silicone para consertar a bolacha para o fundo da caixa de Petri. Nota: Listras de Silicone são feitas de silicone do dois-componente-cola (3 x 12 mm). Seções de imagem em um microscópio invertido usando uma abertura numérica elevada (por exemplo, 160 X / at 1,43; consulte a Tabela de materiais) óleo imersão super resolução dedicado objetivo. Antes da imagem, deixe a amostra equilibrar a temperatura do microscópio, a fim de minimizar/reduzir o desvio lateral e axial. Centro da área de interesse e adquirir primeiro widefield epifluorescência imagens de referência. Mudar para o modo de operação do super resolução. Ajustar o tempo de exposição da câmera para 15 ms e definir o elétron ganho (EM) o máximo de 300 a multiplicar-se. Amostra de iluminar com o 642 nm onda contínua do laser na potência máxima do laser (correspondente a ~2.8 kW/cm 2) no modo de epifluorescência. Assim que a molécula pisca bem são separados em cada quadro, para que a probabilidade é baixa, que sinais individuais se sobrepõem, definir a potência do laser para ~0.7 kW/cm 2. Gravar a imagem raw no modo de epifluorescência através da aquisição de um mínimo de 30.000 frames. Nota: Todos estes parâmetro pode variar dependendo de espécimes diferentes e rotulagem densidades. De dados brutos, gerar uma lista de eventos de reconstrução (localizações de cada molécula blink na imagem raw) usando um limite de deteção de 30 fótons (precisa ser ajustada de acordo com a amostra) clicando " avaliar " no ' t-series análise ' sob ' Tools '. Visualizar a imagem de super resolução por encaixe Gaussian 16 aplicando um tamanho de pixel de renderização de 4 nm clicando " criar imagem " no ' painel de processamento de lista de evento ' sob ' ferramentas. ' Nota: Para gerar a imagem super resolvida as ferramentas de software integrado do sistema utilizado neste estudo foram utilizadas. No entanto, a imagem descrita super resolução poderia ser executada em qualquer outro sistema de localização baseado única molécula, e os dados poderiam ser processados com ferramentas de software de código aberto como tempestade 17. 4. Sombreamento de platina remover listras de silício e adicionar uma gota de PBS perto das bordas do wafer para levantá-la da caixa de Petri. Lave o wafer 2 x 2 min em PBS, então post corrigi-lo com 0,1% de glutaraldeído em PBS por 5 min. Lave 2 x por 2 min/lavagem em PBS. Incubar a bolacha duas vezes por 5 min/incubação em 1 gota de metilcelulose 2% na água, no gelo. Inserir a hóstia num tubo de centrífuga e centrifugar a 14.100 x g durante 90 s. montagem-em um esboço de alumínio SEM com realização de cimento carbono. Adicionar uma camada de 2 a 10 nm de platina/carbono na amostra pelo sombreamento giratório 8 ° usando um elétron feixe configurações de dispositivo de evaporação: 1,55 kV, 55 mA, com 0,3 nm/s e um ângulo de 8°, nível de rotação 4. 5. Microscópio eletrônico de varredura seções de imagem com digitalização em um elétron microscope em 1.5 kV, 2 funcional à distância e com um em lente detector de elétron secundário. 6. Alinhamento de luz e microscopia eletrônica de imagens abrir os dois tipos de imagens com Fiji 18 clicando " arquivo | Aberto ". Ajustar o tamanho da tela clicando " imagem | Ajustar | O tamanho da lona " e trazer as duas imagens para uma pilha clicando " imagem | Pilhas | Imagens a pilha ". Salve a pilha como tipo de arquivo tiff. Em Fiji, abra uma nova interface de 19 TrackEM2 clicando em " arquivo | novo | TrackEM2 (novo) ". Importar a pilha com ambas as imagens, clique com o botão direito na janela preta e selecionando " pilha Import ". Imagem de microscopia luz de alinhar a imagem de microscopia eletrônica manualmente com Marcos usando um clique direito do mouse sobre a imagem e selecionando " Align | Alinhar a camada manualmente com Marcos ". Escolher Selecionar ferramenta (seta preta) para adicionar pontos de referência. Use a forma dos núcleos como referência para selecionar as bordas da mesmas em ambas as imagens (complementar a Figura 1). Adicione vários pontos (mínimos três pontos precisam ser selecionados). Aplicar o alinhamento com um modelo afim por direito do mouse, clicando e selecionando " aplicar transformação | Modelo afim ". Alterar a transparência de camada (ver Figura complementar 1) para avaliar a qualidade do alinhamento.