Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione di ARVO per l’uso degli animali in oftalmica e Vision Research e sono stati approvati dalle autorità locali. 1. preparazione di sezioni ultrasottili su wafer di silicio fissazione del campione preparare la soluzione fissante contenente 0,1% glutaraldeide, formaldeide 4% in tampone cacodilato 0.1 M. Nota: attenzione! Usare cautela quando si lavora con glutaraldeide, formaldeide e cacodylate buffer, indossare adeguati dispositivi di protezione personale e lavorare in una cappa aspirante. Eutanasia 5 giorni dopo la fecondazione (5 dpf) larve di zebrafish con tricaina (methanesulfonate 3-aminobenzoate etilico, 0,4% p/v in PBS (tampone fosfato salino, pH 7)) come descritto in precedenza 15. Difficoltà le larve mediante immersione in soluzione fissante pre-refrigerati sul ghiaccio. Togliere la testa e incubare per una notte a 4 ° C con dolce dondolio. Sezionare gli occhi tagliando il tessuto intorno all’occhio utilizzando una pinzetta e un bisturi di microdissection (sotto un binocolo) in soluzione fissante fresco su una zolla di letti dell’agarosi di 1%. Trasferire gli occhi in una provetta con fissativo fresco pre-refrigerato. Lavare due volte in PBS (tampone fosfato salino, pH 7.4) per 5 min ogni lavaggio a temperatura ambiente (TA). Gelatina infiltrazione e montaggio Warm up 15ml cibo locale marca gelatina 12% p/v in PB (tampone fosfato, 0,1 M a pH 7.4) a 40 ° C. rimuovere il PBS ed aggiungere la soluzione di gelatina per le provette contenenti gli occhi. Toccare il tubo delicatamente per garantire si infiltra in gelatina il campione e incubare per 10-30 min a 40 ° C in un termoblocco con agitazione delicata o in un bagno d’acqua. Silicio riempire 12 x 5 x 3 mm o polietilene piatto incorporamento stampi con gelatina calda in un bagno di acqua 40 ° C. Aggiungere due occhi per muffa usando una pipetta, allinearle correttamente sotto un binocolo utilizzando un ago di dissezione e lasciare che la gelatina raffreddare a temperatura ambiente per 1 min e indurire a 4 ° C per 20 min. Ri-tagliare il blocco di gelatina sotto il binocolo per adattarsi a un occhio per blocco utilizzando una lama di rasoio. Trasferire gli occhi di gelatina incorporato a 2,3 M saccarosio in PB sul ghiaccio. Incubare per una notte a 4 ° C. Cambio alla nuova soluzione di saccarosio di 2,3 M e conservare a 4 ° C o -20 ° C; dopo questo passaggio, i campioni sono pronti per il sezionamento o possono essere conservati a-20 ° C per parecchie settimane ai mesi. Ri-tagliare il blocco di gelatina quasi la dimensione dell’occhio prima di trasferire ad un cryo-pin. Congelamento in azoto liquido e trasferimento in un cryo-ultramicrotomo. Cryosectioning Cut 110 nm di spessore-sezioni a-120 ° C con un coltello di diamante in cryo-ultramicrotomo. Pick le sezioni con un anello via cavo contenente una goccia di 2% metilcellulosa (in acqua) e soluzione di saccarosio di 2,3 M (1:1). Trasferimento sezioni per un wafer di silicio di 7 x 7 mm. Memorizzare sezioni a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione. 2. Immunolabelling wafer di lavaggio con PBS a 0 ° C per 20 min su quattro gocce mettendo sottosopra i wafer sulle gocce. Lavaggio in PBS 2 x 2 min a temperatura ambiente. Incubare 3 volte da glicina 0,15% in PBS, per 1 min ciascuna. Lavare 3x per 1 min/lavaggio con PBS. Pre-incubate con PBG (PBS con 0,5% di sieroalbumina bovina BSA e 0,2% gelatina tipo B) per 5 min. Incubare con coniglio anti-Tom20 (Vedi la Tabella materiali) in PBG (4 µ g/mL) per 30 min a temperatura ambiente. Lavare 6x per 1 min/lavaggio in PBG. Pre-incubate con PBG per 5 min a RT. Incubare con anti-coniglio Alexa 647 F(ab') 2 (Vedi la Tabella materiali) in PBG (7,5 µ g/mL) per 30 min. Lavare 6x per 1 min/lavaggio in PBG. Lavare 3 x 2 min in PBS. Incubare con DAPI (4 µ g/mL) in PBS per 10 s. Wash 2 x 2 min in PBS. 3. Microscopia di Super-risoluzione Incubare la cialda brevemente (10 s) ponendolo su una goccia di una soluzione di 1:1 di glicerolo (80%) e tampone contenente un ossigeno lo scavenging sistema (200 mM di tampone fosfato contenente glucosio 10%, 0,5 mg/mL di imaging Glucoseoxidase, 40 catalasi µ g/mL, beta-mercaptoethylamine cloridrato di 15 mM (MEA HCL), pH 8.0). Trasferire i wafer (sezione rivolto verso il basso) per un piatto di Petri vetro inferiore (spessore 170 ± 5 µm) su una fresca goccia di miscela 1:1 di glicerolo (80%) e imaging buffer (come descritto al punto 3.1). Rimuovere da tutti i lati, con una pipetta, la maggior parte del liquido sotto il wafer. Utilizzare strisce di silicone per correggere la cialda sul fondo del piatto Petri. Nota: Strisce di Silicone sono fatte di silicone-colla a due componenti (3 x 12 mm). Immagine sezioni su un microscopio invertito usando un’apertura numerica elevata (ad esempio 160 X / NA 1,43; si veda la Tabella materiali) obiettivo dedicato a super risoluzione immersione in olio. Prima di formazione immagine, lasciate che il campione equilibrare a temperatura microscopio al fine di ridurre al minimo/ridurre la deriva laterale e assiale. Centro della zona di interesse e acquisire immagini di riferimento primi widefield epifluorescenza. Modificare la modalità di funzionamento di super risoluzione. Regolare il tempo di esposizione della fotocamera a 15 ms e impostare l’elettrone moltiplicando il guadagno (EM) ad un massimo di 300. Campione di illuminare con la 642 laser ad onda continua nm a potenza massima laser (corrispondente a ~2.8 kW/cm 2) in modalità epifluorescenza. Non appena la singola molecola lampeggia sono ben separati in ogni fotogramma, in modo che la probabilità è bassa che singoli segnali si sovrappongono, impostare la potenza del laser a ~0.7 kW/cm 2. Registrare l’immagine raw in modalità epifluorescenza con l’acquisizione di un minimo di 30.000 fotogrammi. Nota: Tutti questi parametri possono variare a seconda di diversi esemplari ed etichettatura densità. Da dati grezzi, generare un elenco di eventi di ricostruzione (localizzazioni di ogni singola molecola batter nell’immagine raw) utilizzando una soglia di rilevamento di 30 fotoni (deve essere adattata secondo il campione) cliccando " Evaluate " alla ' t-serie analisi ' sotto ' Strumenti '. Visualizzare l’immagine di super risoluzione di raccordo gaussiana 16 applicando una dimensione di pixel rendering di 4 nm cliccando " Crea immagine " alla ' pannello elaborazione di evento elenco ' sotto ' strumenti. ' Nota: Per generare l’immagine super risolto gli strumenti software integrato del sistema utilizzato in questo studio sono stati impiegati. Tuttavia, l’imaging di super risoluzione descritta può essere eseguita su qualsiasi altro sistema di localizzazione basato su singola molecola, e possono essere trattati i dati con strumenti software open source come temporale 17. 4. Shadowing platino rimuovere le strisce di silicio e aggiungere una goccia di PBS vicino ai bordi del wafer per sollevarlo da di Petri. Lavare il wafer 2 x 2 min in PBS, poi post fissarlo con 0,1% glutaraldeide in PBS per 5 min. lavare 2x per 2 min/lavaggio in PBS. Incubare la cialda due volte per 5 min/incubazione in 1 goccia di metilcellulosa 2% in acqua sul ghiaccio. Inserire la cialda in una provetta da centrifuga e centrifugare a 14.100 x g per 90 s. Monte e su un albero mozzo alluminio SEM con lo svolgimento di cemento carbonio. Aggiungere uno strato di 2-10 nm di platino/carbonio sul campione lo shadowing rotativo a 8° utilizzando un elettrone del fascio le impostazioni del dispositivo di evaporazione: 1,55 kV, 55 mA, a 0,3 nm/s e un angolo di 8°, livello di rotazione 4. 5. Microscopia elettronica a scansione sezioni di immagine con scansione elettrone microscope a 1,5 kV, 2 mm di lavoro distanza e con un In lente detector elettronico secondario. 6. Allineamento di luce e di microscopia elettronica immagini Apri entrambi tipi di immagini con Fiji 18 cliccando " File | Aperto ". Regolare la dimensione della tela facendo " immagine | Regolare | Tela di dimensioni " e portare entrambe le immagini a una pila facendo " immagine | Stack | Immagini di stack ". Salvare lo stack come tipo di file tiff. In Fiji, aprire una nuova interfaccia di 19 TrackEM2 facendo " File | nuovo | TrackEM2 (nuovo) ". Importare lo stack con entrambe le immagini facendo clic destro sulla finestra nera e selezionando " stack di importazione ". Immagine di microscopia luce allineare all’immagine di microscopia elettronica manualmente con punti di riferimento utilizzando un clic destro del mouse sull’immagine e selezionando " Align | Allineare il livello manualmente con luoghi d’interesse ". Pick Seleziona strumento (la freccia nera) per aggiungere punti di riferimento. Utilizzare la forma dei nuclei come riferimento per selezionare gli stessi bordi in entrambe le immagini (complementare figura 1). Aggiungere diversi punti (minimi tre punti necessita di essere selezionata). Applicare l’allineamento con un modello affine di destro del mouse scegliendo e selezionando " applica trasformazione | Modello affine ". Cambiare la trasparenza del layer (vedere complementare figura 1) per valutare la qualità dell’allineamento.