القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد
Summary
ويصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة للحصول على نتائج التعريب سوبسيلولار البروتين في الشبكية الزرد بربط القرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب ومسح صور المجهر الإلكتروني.
Abstract
نحن نقدم طريقة للتحقيق التعريب سوبسيلولار البروتين في الشبكية الزرد اليرقات بالجمع بين القرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب وفحص المجهر الإلكتروني. قدرات القرار الحد حيود الفرعية مجاهر الخفيفة فائقة القرار السماح بتحسين دقة البيانات المرتبطة. بإيجاز، 110 نانومتر سميكة البرد، أقسام يتم نقلها إلى رقاقة سيليكون، وبعد الفلورة تلطيخ، يتم تصويرها بالقرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب. وفي وقت لاحق، يتم الحفاظ على المقاطع في ميثيلسيلولوسي والبلاتين مظلل قبل التصوير في المسح الإلكتروني المجهري (SEM). يتم دمج الصور من هذه الطرائق مجهرية اثنين بسهولة باستخدام معالم النسيج مع برمجيات المصدر المفتوح. هنا يصف لنا طريقة تكيف الشبكية الزرد اليرقات. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطبق أيضا على أنواع أخرى من الأنسجة والكائنات الحية. ونحن تبين أن المعلومات التكميلية التي حصلت عليها هذه العلاقة قادراً على حل تعبير البروتينات المتقدرية في علاقة مع الأغشية وكريستاي الميتوكوندريا، وكذلك فيما يتعلق بالأقسام الأخرى من الخلية.
Introduction
أساليب لتحديد الترجمة سوبسيلولار للبروتينات وعلاقتها بالأقسام المختلفة للخلية أدوات أساسية لفهم الوظائف والتفاعلات المحتملة. مجهرية فائقة القرار في تركيبة مع الميكروسكوب الإلكتروني يوفر هذه المعلومات1. أرض الدولة نضوب مجهرية تليها عودة جزيء فردية (جسديم) هو تقنية مجهرية فائقة قرار متوافقة مع مجموعة واسعة من فلوروفوريس العضوية ومُرمّز وراثيا2 ويحقق قرارا أفقي بما يصل إلى 20 nm 3-إدماج أساليب مع دقة أعلى من معيار حيود محدودة مجهرية يحسن دقة5،،من4الارتباط6. ينصح من أجل تحقيق ترابط أفضل من تعبير البروتين مع حجرة سوبسيلولار محددة وتقليص حجم عدم اليقين7 استخدام نفس المقطع سامسونج للضوء والمجهر الإلكتروني. بين أساليب تقطيع مختلفة، توكوياسو البرد-قسم البروتوكول لا يتطلب الجفاف أو الراتنج التضمين، بالإضافة إلى ذلك، يحافظ على أنتيجينيسيتي من كثير من [ابيتوبس] ويوفر الأنسجة جيدة أولتراستروكتوري8. وقد أثبتت عدة طرق انطباق هذه الأقسام في ضوء الارتباطية والمجهر الإلكتروني (كليم)4،5،،من910.
الشبكية الزرد نموذجا قيماً لدراسة التنمية البصرية وآليات المرض البشري نظراً لهيكلها عاليا المصانة ووظيفة عبر الفقاريات. في عرض فوتوريسيبتورس الشبكية وخاصة نفس بنية ك photoreceptors الثدييات، مع المشبك القاعدية، نواة أبيكو بأسالي ممدود، تجميع الميتوكوندريا في الجزء الداخلي قمي أكثر وجزء خارجي يتكون من الغشاء الأقراص في موقف آخر قمي11. الترجمة البروتين إلى المقصورات الخلوية المتنوعة المصانة بين الزرد والبشرية، مما يتيح تحقيق الوظيفة البيولوجية للبروتينات ذات الصلة بالمرض البشري12،13.
نقدم هنا بروتوكولا لإعداد اليرقات الزرد عينات الشبكية لحل تعريب البروتين المتقدرية الغشاء الخارجي Tom20 بالقرار فائقة الارتباطية الضوء والمجهر الإلكتروني. الأسلوب الذي يستند إلى جمع المقاطع البرد على رقائق السيليكون والحصول على تباين المعلومات الطوبوغرافية التي أنتجت بعد تطبيق طبقة رقيقة من البلاتين. هذه الخطوات تحسينات فنية واضحة من حيث سهولة الاستخدام وإمكانية تكرار نتائج، والوقت لإكمال التجارب. قد أظهرنا مؤخرا إمكانية تطبيق أسلوب للكشف عن المسام النووية والبروتينات المتقدرية في الماوس الأنسجة14.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجمع هذا الأسلوب التعريب البروتين تحل فائقة مع معلومات سياق لتحديد الموضع الدقيق من البروتينات في عضية. علينا أن نظهر هنا انتهاء التجربة إلى تصور التعبير عن Tom20 في الغشاء الخارجي من الميتوكوندريا، وعلاقتها بغيرها العضيات مثل نوى أو شرائح الخارجي لمستقبله في الشبكية الزرد اليرقات.
توكوياسو البرد تمزيقها يتطلب بعض التدريب اكتساب المقاطع يتم الحفاظ عليها جيدا. ومع ذلك، هذا أسلوب المستخدمة في العديد من المختبرات مع إثبات النجاح21. نقل المقاطع إلى رقاقة السيليكون بسيط جداً وهناك حاجة إلى لا اعتبارات خاصة. استخدام الجلسرين في المخزن المؤقت للتصوير خطوة حاسمة جداً لتجنب تجفيف الأقسام. لتصوير فائقة القرار يتم الحصول على أفضل النتائج عند الرقاقة قريبة جداً من أسفل الزجاج طبق بيتري. المشارب سيليكون تساعد على الحفاظ على يفر في هذا الموقف. الرعاية الخاصة التي يجب اتخاذها أثناء إزالة المشارب تفاديا لإلحاق أضرار في بعض المقاطع.
سمك cryo-الفروع، حوالي 100 نانومتر، أرق من الدقة البصرية في Z-البعد، بالإضافة إلى ذلك يسهل دقة هذا الأسلوب ستتحقق كما إشارة مجهرية فائقة القرار قادم من هذا طبقة رقيقة فقط يتم عرض إشارة المسح الإلكتروني المجهري طبوغرافية العينة. يمكن أيضا الجمع بين هذه الطريقة تصوير متعدد الألوان. ومع ذلك، يجب إيلاء عناية خاصة أن العينة يمكن تصويرها تحت نفس الظروف (مثلاً التصوير العازلة) وينبغي منع التحدث عبر.
واحد الحد من الأسلوب هو اثنين الأبعاد النهج، حيث يمكن جمعها بعدد محدود فقط من مقاطع المسلسل (حوالي 3 إلى 7 كل رقاقة). وهكذا، مشاريع تتناول تحليل وحدة التخزين لن يكون مثاليا. ومع ذلك، هو أسلوب التي يمكن تطبيقها على الكشف عن البروتين التعبير في أي نوع من الأنسجة بتقطيع بسيط للعينة. نحن نقدم طريقة دون استخدام عوامل التباين الكلاسيكية مثل سترات الرصاص أو خلات اليورانيل. على النقيض من التظليل البلاتين يوفر التباين الطبوغرافية مفيدة للغاية، ولكن في بعض الحالات يصعب أغشية من حلها. وهذا قد يثير مشاكل للمشاريع التي تحتاج، على سبيل المثال، لتحديد التعبير عن البروتينات في حويصلات صغيرة.
لدينا البروتوكول، على أساس cryo توكوياسو-أقسام، يستخدم المعدات القياسية للحصول على النتائج ستتحقق من القرار فائقة ومجاهر المسح الإلكترون. مجموعة المقاطع على رقائق السيليكون واستخدام البلاتين للتباين خطوات بسيطة لتوفير الاستقرار وإمكانية تكرار نتائج لإعداد نموذج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل أيون و RGB: منح العلوم الوطنية السويسرية مؤسسة أمبيزيوني نقاط PZ00P3 142404/1 و PZ00P3 163979.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | #158127 | |
| Glutaraldehyde EM Grade | EMS, USA | #16220 | |
| Cacodylate | Merck | #8.20670 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
| Agarose, peqGOLD Universal | VWR International GmbH | 35-1020 | |
| Flat embedding molds | BEEM Flat | ||
| Local food brand gelatin | Dr.Oetker | Extra Gold | |
| Sucrose | Merck | #1.07687 | |
| Methylcellulose | Sigma | #M-6385 | |
| Glycine | Sigma | #G-7126 | |
| Gelatin type B | Sigma | #G-6650 | |
| BSA | Applichem | #A6588.0050 | |
| Silicon wafer | Si-Mat Silicon Materials | Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm | |
| Cryo-pin | Baltic Preparation | #16701950 | |
| Wired loop "Perfect loop" | |||
| Silicone stripes | Picodent | Twinsil 22 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
| glucoseoxidase | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | #C40 | |
| beta-Mercaptoethylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
| anti-Tom20 | Santa Cruz Biotechnology | #sc – 11415 | |
| AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
| DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
| Glycerol solution | Sigma-Aldrich | #49782 | |
| Glass bottom petri dish | Ibidi, Germany | u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158 | |
| SEM aluminium stub | Agar Scientific | #G301F | |
| Conducting carbon cement Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Diamond Knife (Cryo Immuno) | Diatome | DCIMM3520 | |
| Cryo-ultramicrotome | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
| Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
| 160x 1.43 TIRF objective | Leica Microsystems | 11523048 | |
| SEM – Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
| FIB-SEM – Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |
References
- Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities. Chem Rev. , (2017).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Fölling, J., Bossi, M., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy. PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).
- Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Suleiman, H., Zhang, L., et al. Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane. eLife. 2, e01149 (2013).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking. Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).
- Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking. PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).
- Mateos, J. M., Guhl, B., et al. Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy. Sci Rep. 6, 34062 (2016).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., Saalfeld, S., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).
- Wurm, C. A., Neumann, D., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).
