Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van de ARVO voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek en zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten. 1. voorbereiding van de uiterst dunne secties op silicium-wafels monster fixatie bereid de kleefpoeders oplossing met 0,1% Glutaaraldehyde, 4% formaldehyde in 0,1 M cacodylate buffer. Opmerking: Let op! Wees voorzichtig bij het werken met formaldehyde, Glutaaraldehyde en cacodylate buffer, passende persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen en werken in een zuurkast. Euthanaseren 5 dagen post bevruchting (5 dpf) zebrafish larven met tricaïne (ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate, 0,4% w/v in PBS (phosphate buffer zoutoplossing, pH 7)) als eerder beschreven 15. Bevestigen de larven door onderdompeling in vooraf gekoeld kleefpoeders oplossing op ijs. Verwijderen van het hoofd en na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zachte rockende. Ontleden de ogen door te korten van het weefsel rond het oog met fijne pincet en een microdissection scalpel (onder een verrekijker) in gekoeld kleefpoeders oplossing op een plaat 1% agarose-bedden. De ogen overbrengen in een buis met verse vooraf gekoeld fixeerspray. Wassen tweemaal in PBS (phosphate buffer zoutoplossing, pH 7.4) gedurende 5 minuten elk wassen bij kamertemperatuur (RT). Gelatine infiltratie en montage opwarmen 15 mL lokaal voedsel merk gelatine 12% w/v in PB (fosfaatbuffer, pH van de 0,1 M 7.4) bij 40 ° C. de PBS verwijderen en toevoegen van gelatine oplossing aan de buizen met de ogen. Tik op de tube zachtjes om te zorgen voor de gelatine infiltreert het monster en incubeer gedurende 10-30 min bij 40 ° C in een thermoblock met zacht schudden of in een waterbad. Vul 12 x 5 x 3 mm silicium of polyethyleen platte mallen te embedding met warme gelatine in een waterbad van 40 ° C. Toevoegen van twee ogen per schimmel met behulp van een precisiepipet, ze uitlijnen onder een verrekijker met behulp van een naald dissectie en laat de gelatine afkoelen bij kamertemperatuur voor 1 min en harden bij 4 ° C gedurende 20 min. Opnieuw trim de gelatine blok onder de binoculair aan één oog per blok met behulp van een scheermesje. Overbrengen in de ogen van de gelatine ingesloten 2,3 M sacharose in PB op ijs. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Exchange om nieuwe 2,3 M sacharoseoplossing en sla bij 4 ° C of -20 ° C; na deze stap, monsters zijn klaar voor het segmenteren of kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor enkele weken tot maanden. Trim opnieuw de gelatine blok bijna de grootte van het oog vóór de overbrenging naar een cryo-pin. Freeze in vloeibare stikstof en overdracht aan een cryo-ultramicrotome. Cryosectioning gesneden 110 nm dik-sections bij-120 ° C met een mes van de diamant in de cryo-ultramicrotome. Halen de secties met een vast lus met een druppel van 2% methylcellulose (in water) en een sacharoseoplossing 2,3 M (1:1). Secties overbrengen in een 7 x 7 mm silicium wafer. Secties bij 4 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt. 2. Immunolabelling Wash wafels met PBS bij 0 ° C gedurende 20 minuten op vier druppels door het plaatsen van de wafeltjes ondersteboven op de druppels. Wassen in PBS 2 x 2 min bij kamertemperatuur. Incubate 3 keer in 0,15% glycine in PBS, voor elke 1 min. 3 x voor 1 min wassen/wassen met PBS. Vooraf incubate met PBG (PBS met 0,5% bovien serumalbumine BSA en 0,2% gelatine type B) voor 5 min. Incubate met konijn anti-Tom20 (Zie de Tabel van materialen) in PBG (4 µg/mL) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Wassen 6 x voor 1 min/afwas in PBG. Vooraf incubate met PBG voor 5 min op RT. Incubate met anti-konijn Alexa 647 F(ab') 2 (Zie de Tabel van materialen) in PBG (7,5 µg/mL) voor 30 min. Wassen 6 x voor 1 min/afwas in PBG. 3 x 2 min in PBS wassen. Incubeer met DAPI (4 µg/mL) in PBS voor 10 s. wassen 2 x 2 min in PBS. 3. Super resolutie microscopie Incubate de wafer kort (10 s) door de plaatsing ervan op een druppel van een 1:1 oplossing van glycerol (80%) en imaging buffer met een zuurstof opruiming systeem (200 mM fosfaatbuffer met 10% glucose, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 µg/mL katalase, 15 mM bèta-mercaptoethylamine hydrochloride (HCL MEA), pH 8,0). De wafeltjes (sectie naar beneden) overbrengen in een petrischaal voor glazen bodem (dikte 170 ± 5 µm) op een nieuwe daling van het 1:1 mengsel van glycerol (80%) en imaging buffer (zoals in stap 3.1). Verwijderen van alle kanten, met een pipet, allermeest naar de vloeistof onder de wafer. Gebruik van silicone strepen om te repareren het zegel aan de onderkant van de petrischaal. Opmerking: Silicone strepen worden gemaakt uit twee componenten siliconen-lijm (3 x 12 mm). Afbeelding secties op een omgekeerde Microscoop met een hoge numerieke diafragma (bijvoorbeeld 160 X / nb 1,43; Zie de Tabel van materialen) olie onderdompeling super resolutie speciale doelstelling. Voorafgaand aan de beeldvorming, laat het monster equilibreer tot Microscoop temperatuur teneinde minimaliseren/laterale en axiale drift. Center van het interessegebied en eerste widefield epifluorescence referentie beelden te verwerven. Wijzig in de bewerkingsmodus super resolutie. De blootstellingstijd van de camera naar 15 ms aanpassen en instellen van het elektron te vermenigvuldigen (EM) winst tot het maximum van 300. Verlichten monster met de 642 nm continuous wave laser op maximale laser kracht (overeenkomend met ~2.8 kW/cm 2) in de epifluorescence modus. Zodra het enkel molecuul knippert zijn goed gescheiden in elk frame, zodat de kans op lage dat individuele signalen overlappen, stel de macht van de laser om ~0.7 kW/cm 2. Opnemen van de onbewerkte afbeelding in epifluorescence modus door het verwerven van een minimum van 30.000 frames. Opmerking: Deze parameter All kan variëren afhankelijk van de verschillende exemplaren en labelen van dichtheden. Van de ruwe gegevens, het genereren van een gebeurtenissenlijst wederopbouw (lokalisaties van elke één molecuul knipperen in het ruwe beeld) met behulp van een drempel van de detectie van 30 fotonen (dient te worden aangepast volgens het monster) door te klikken op " evalueren " in de ' t-serie analyse ' onder ' Tools '. Het super resolutiebeeld visualiseren door Gauss montage 16 toe te passen van een pixelgrootte van de rendering van 4 nm door te klikken op " Create Image " in de ' gebeurtenis lijst verwerking paneel ' onder ' Tools. ' Opmerking: Voor het genereren van de super opgelost afbeelding de geïntegreerde software-tools van het systeem gebruikt in deze studie werden ingezet. Echter de beeldvorming beschreven super resolutie kan worden uitgevoerd op een ander enkel molecuul lokalisatie gebaseerd systeem en de gegevens kan worden verwerkt met opensource software gereedschappen als onweer 17. 4. Platina Shadowing verwijderen van silicium strepen en voeg een druppel PBS dicht bij de randen van het zegel aan het verheffen van de petrischaal. Wassen van de wafer 2 x 2 min in PBS, dan post repareren met 0,1% Glutaaraldehyde in PBS voor 5 min. 2 x gedurende 2 minuten wassen/wassen in PBS. Broeden de wafer tweemaal voor 5 min/incubatie in 1 druppel methylcellulose 2% in water op het ijs. De wafer invoegen in een centrifugebuis samen en centrifugeer bij 14,100 x g voor 90 s. Mount het op een SEM aluminium beginnetje met het uitvoeren van koolstof cement. Toevoegen van een laag van 2 tot en met 10 nm van platina/carbon op de steekproef door het roterende shadowing bij 8° met behulp van een elektron beam verdamping Apparaatinstellingen: 1.55 kV, 55 mA, 0.3 nm/s, en een hoek van 8°, rotatie niveau 4. 5. Scanning elektronen microscopie afbeelding secties met een scanning electron microscope op 1,5 kV, 2 mm werken afstand en lens met een In secundaire electron detector. 6. Uitlijning van licht- en elektronenmicroscopie beelden Open beide typen afbeeldingen met Fiji 18 door te klikken op " bestand | Open ". De canvasgrootte van het aanpassen door te klikken op " afbeelding | Aanpassen | Canvasgrootte " en beide beelden brengen in een stapel door te klikken op " afbeelding | Stapels | Afbeeldingen stapelen ". De stack opslaan als TIFF-bestandstype. In Fiji, een nieuwe TrackEM2 19-interface openen door te klikken op " bestand | nieuw | TrackEM2 (nieuw) ". De stapel met beide afbeeldingen importeren door rechts te klikken op het zwarte venster en selecteren " Import stapel ". Uitlijnen licht microscopie afbeelding naar elektronenmicroscopie afbeelding handmatig met bezienswaardigheden met behulp van een rechter muisklik op de afbeelding en selecteren " uitlijnen | Uitlijnen van laag handmatig met bezienswaardigheden ". Pick de Selecteer gereedschap (zwarte pijl) om toe te voegen van monumenten. De vorm van kernen gebruiken als referentie om te selecteren van de dezelfde randen in beide afbeeldingen (aanvullende figuur 1). Voeg meerdere punten (minimum drie punten moeten worden geselecteerd). Uitlijning met een affiene model toepassen door rechtermuisknop op te klikken en te selecteren " transformatie toepassen | Affiene model ". Laag transparantie wijzigen (Zie aanvullende figuur 1) te beoordelen van de kwaliteit van de uitlijning.