Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

toutes les expériences ont été effectuées conformément à la déclaration d’ARVO sur l’utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et ont été approuvées par les autorités locales. 1. préparation des coupes ultrafines sur des plaquettes de silicium fixation d’échantillon préparer la solution de fixation contenant 0,1 % de glutaraldéhyde, formaldéhyde à 4 % dans un tampon cacodylate 0,1 M. Remarque : attention ! Soyez prudent lorsque vous travaillez avec tampon glutaraldéhyde, formaldéhyde et cacodylate, porter un équipement de protection individuelle approprié et travailler sous une hotte. Euthanasier 5 jours après la fécondation (dpf 5) des larves de poisson zèbre avec tricaïne (méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle, 0,4 % p/v dans du PBS (tampon phosphate salin, pH 7)) comme décrit précédemment 15. Fixer les larves par immersion dans une solution fixateur préalablement refroidie sur la glace. Retirez la tête et incuber une nuit à 4 ° C, avec balancement doux. De disséquer les yeux en taillant les tissus autour de le œil à l’aide de pince fine et un scalpel microdissection (sous jumelles) en solution de fixation réfrigérée sur une plaque de gel d’agarose-lités de 1 %. Transférer les yeux dans un tube avec fixateur préalablement réfrigéré fraîche. Laver deux fois dans du PBS (tampon phosphate salin, pH 7,4) pendant 5 min chaque lavage à température ambiante (RT). Infiltration de gélatine et de montage Warm up 15 mL nourriture locale marque gélatine 12 % p/v dans PB (tampon phosphaté, 0,1 M, pH 7,4) à 40 ° C. Retirer le PBS et ajouter la solution de gélatine pour les tubes contenant les yeux. Appuyez sur le tube doucement pour s’assurer que les gélatine infiltrats l’échantillon et incuber pendant 10 à 30 min à 40 ° C dans un thermoblock avec agitant doucement ou dans un bain d’eau. Silicium remplir 12 x 5 x 3 mm ou polyéthylène plat intégrant des moules avec de la gélatine chaude dans un bain d’eau de 40 ° C. Ajouter deux yeux par moule à l’aide d’une pipette, alignez-les correctement sous jumelles à l’aide d’une aiguille de dissection et laissez les feuilles de gélatine refroidir à température ambiante pendant 1 min et durcir à 4 ° C pendant 20 min. Re-tailler le bloc de gélatine sous les jumelles pour s’adapter à un seul œil par bloc à l’aide d’une lame de rasoir. Transfert aux yeux de gélatine incorporé à 2,3 M de sucrose dans PB sur la glace. Incuber une nuit à 4 ° C. Exchange à la nouvelle solution de sucrose à 2,3 M et conserver à 4 ° C ou -20 ° C ; après cette étape, les échantillons sont prêts pour le sectionnement ou peuvent être stockés à-20 ° C pendant plusieurs semaines ou mois. Re-tailler le bloc de gélatine à presque la taille de le œil avant de les transférer à une broche-cryo. Congélation dans l’azote liquide et le transfert d’une cryo-ultramicrotome. Cryosectioning coupe 110 nm d’épaisseur-sections à-120 ° C avec un couteau de diamant dans la cryo-ultramicrotome. Choisir les sections avec une boucle filaire contenant une goutte de 2 % de méthylcellulose (en eau) et de solution de saccharose de 2,3 M (1:1). Transfert en sections d’une plaquette de silicium de 7 x 7 mm. Stocker les sections à 4 ° C jusqu’à ce que la poursuite de la procédure. 2. Immunomarquage gaufrettes de lavage avec du PBS à 0 ° C pendant 20 min sur quatre gouttes en plaçant les plaquettes à l’envers sur les gouttes. Laver dans du PBS 2 x 2 minutes à température ambiante. Incuber 3 fois à 0,15 % de glycine dans du PBS, pendant 1 min chaque. Laver 3 fois pendant 1 min/laver avec du PBS. Avant incubate avec PBG (PBS avec 0,5 % d’albumine sérique Bovine BSA et 0,2 % gélatine type B) pendant 5 min. Incuber avec lapin anti-Tom20 (voir la Table des matières) dans PBG (4 µg/mL) pendant 30 min à température ambiante. Laver 6 x 1 min/lave en photonique. Avant incubate avec PBG pendant 5 min à RT. Incuber avec anti-lapin Alexa 647 F(ab') 2 (voir la Table des matières) dans PBG (7,5 µg/mL) pendant 30 min. Laver 6 x 1 min/lave en photonique. Laver 3 x 2 min dans du PBS. Incuber au DAPI (4 µg/mL) dans du PBS pendant 10 s. lavage, 2 x 2 min dans du PBS. 3. Microscopie de Super-résolution incuber la gaufrette brièvement (10 s) en le plaçant sur une goutte d’une solution de 1:1 de glycérol (80 %) et l’imagerie tampon contenant un oxygène nettoyage système (200 mM tampon Phosphate contenant 10 % de glucose, 0,5 mg/mL oxydase, catalase de µg/mL 40, chlorhydrate de bêta-mercaptoethylamine de 15 mM (MEA HCL), pH 8,0). Imagerie tampon (comme à l’étape 3.1) et de transférer les gaufres (section vers le bas) dans un plat de Pétri de verre bas (épaisseur 170 ± 5 µm) sur une nouvelle goutte du mélange 1:1 de glycérol (80 %). Enlever de tous les côtés, avec une pipette, la plupart du liquide sous la plaquette. Utiliser des bandes de silicone pour fixer la plaquette au fond de la boîte de Pétri. NOTE : Bandes de Silicone sont faites de silicone-colle à deux composants (3 x 12 mm). Image sections sur un microscope inversé à l’aide d’une grande ouverture numérique (par exemple 160 X / NA 1,43 ; Voir la Table des matières) objectif dédié Super-résolution à immersion à huile. Avant l’imagerie, laisser l’échantillon est proportionnelle à la température de microscope afin de minimiser/réduire la dérive latérale et axiale. Centre de la zone d’intérêt et acquérir les premières images de référence widefield épifluorescence. Remplacez le mode de fonctionnement de super résolution. Régler la durée d’exposition de la caméra à 15 ms et fixer l’électron multipliant gain (EM) au maximum de 300. Échantillon s’allument avec le 642 nm onde entretenues laser à puissance maximale de laser (correspondant à ~2.8 kW/cm 2) en mode épifluorescence. Dès que la molécule unique clignote sont bien séparées dans chaque cadre, afin que la probabilité est faible que des signaux individuels se chevauchent, la valeur de la puissance du laser à ~0.7 kW/cm 2. Enregistrer l’image raw en épifluorescence mode en acquérant un minimum de 30 000 images. NOTE : Tous ces paramètres peuvent varier selon différents spécimens et étiquetage densités. Partir des données brutes, générer une liste d’événements de reconstruction (localisations de chaque clignotement seule molécule dans l’image raw) en utilisant un seuil de détection de 30 photons (doit être ajustée selon l’exemple) en cliquant sur " Evaluate " dans le ' t-series analyse ' sous ' outils '. Visualiser l’image de Super-résolution par raccord gaussien 16 appliquer une taille de pixel de rendu de 4 nm en cliquant sur " créer une Image " dans les ' panneau de traitement liste événement ' sous ' outils. ' Remarque : Les outils logiciels intégrés du système utilisé dans cette étude étaient employées pour générer l’image super résolu. Toutefois, l’imagerie décrit super résolution pouvait être effectuée sur n’importe quel autre système de localisation basée seule molécule et les données ont été traitées avec des outils logiciels open source comme orage 17. 4. Observation en situation de platine enlever les rayures de silicium et ajouter une goutte de PBS à proximité des bords de la gaufrette pour la soulever vers le haut de la boîte de Pétri. Laver la gaufrette 2 x 2 min dans du PBS, puis post Fixez-le avec 0,1 % de glutaraldéhyde dans du PBS pour 5 min. laver 2 fois pendant 2 min/cycle de lavage en PBS. Incuber les plaquettes deux fois pour 5 min/incubation dans 1 goutte de méthylcellulose 2 % dans de l’eau sur la glace. Insérer la plaquette dans un tube à centrifuger et centrifuger à 14 100 x g pendant 90 s. Mont il sur une ébauche d’aluminium SEM sous la direction de ciment carbone. Ajouter une couche de 2 à 10 nm de platine/carbone sur l’échantillon par ombrage rotatif à 8° à l’aide d’un électron faisceau de paramètres de périphérique d’évaporation : 1,55 kV, 55 mA, à 0,3 nm/s et un angle de 8°, niveau de rotation 4. 5. Microscopie électronique à balayage sections de l’Image avec un balayage électronique microscope à 1,5 kV, 2 mm de travail à distance et avec un objectif détecteur d’électrons secondaires. 6. Alignement de lumière et d’Images de microscopie électronique ouvert les deux types d’images avec Fidji 18 en cliquant sur " fichier | Ouvert ". Ajustez la taille du canevas en cliquant sur " Image | Ajuster | Taille du canevas " et porter les deux images à une pile en cliquant sur " Image | Piles | Images à empiler ". Économiser la pile en tant que type de fichier tiff. À Fidji, ouvrez une nouvelle interface de 19 TrackEM2 en cliquant sur " fichier | nouveau | TrackEM2 (nouveau) ". Importer la pile avec les deux images en un clic droit sur la fenêtre noire et en sélectionnant " pile d’importation ". Image de microscopie Align lumière à l’image de microscopie électronique manuellement avec des points de repère en utilisant un clic droit de la souris sur l’image puis sélectionnez " Align | Aligner le calque manuellement avec des points de repère ". Pick select tool (flèche noire) pour ajouter des points de repère. Utilisez la forme des noyaux comme référence pour sélectionner les arêtes de mêmes dans les deux images (supplémentaire Figure 1). Ajouter plusieurs points (minimum de trois points doivent être choisis). Appliquer l’alignement avec un modèle affine en droit de la souris en cliquant et en sélectionnant " appliquer transformation | Modèle affine ". Changer la couche de transparence (voir figure1 supplémentaire) pour évaluer la qualité de l’alignement.