Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.
Abstract
Wir präsentieren Ihnen eine Methode, um die subzelluläre Protein-Lokalisierung in der Larven Zebrafisch Netzhaut zu untersuchen, durch die Kombination Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie. Die Sub-Beugung begrenzt Auflösung Fähigkeiten von Lichtmikroskopen Höchstauflösung zulassen Verbesserung der Genauigkeit der korrelierten Daten Kurz gesagt, 110 Nanometer Dicke Cryo-Abschnitte werden auf einem Silizium-Wafer übertragen und nach Immunfluoreszenz-Färbung, durch Lichtmikroskopie Höchstauflösung abgebildet sind. Anschließend sind die Abschnitte in Methylcellulose und Platin beschattet vor Bildgebung in einem Rasterelektronenmikroskop (REM) erhalten. Die Bilder von diesen zwei Mikroskopie-Modalitäten sind leicht zusammengeführt mit Gewebe Wahrzeichen mit open-Source-Software. Hier beschreiben wir die angepasste Methode für die Larven Zebrafisch-Netzhaut. Diese Methode ist jedoch auch für andere Arten von Geweben und Organismen. Wir zeigen, dass die ergänzende Informationen durch diese Korrelation in der Lage, den Ausdruck der mitochondrialen Proteine im Zusammenhang mit den Membranen und Cristae der Mitochondrien sowie zu anderen Abteilungen der Zelle zu lösen ist.
Introduction
Methoden zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen und deren Beziehung zu verschiedenen Kompartimenten der Zelle sind wesentliche Instrumente, um ihre Funktionen und möglichen Wechselwirkungen zu verstehen. Super-Auflösung Mikroskopie in Kombination mit Elektronenmikroskopie bietet solche Informationen1. Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie, gefolgt von einzelnen Molekül Rückkehr (GSDIM) ist eine super-Resolution-Mikroskopie-Technologie kompatibel mit einer Vielzahl von organischen und genetisch codierte Fluorophore2 und erreicht eine laterale Auflösung bis zu 20 nm 3. die Einbeziehung von Methoden mit höherer Auflösung als standard Beugung begrenzte Mikroskopie verbessert die Genauigkeit der Korrelation4,5,6. Um die beste Korrelation der Proteinexpression mit einem spezifischen subzelluläre Fach zu erreichen und die Unsicherheit7 die Verwendung der gleichen ultradünnen Sektion für Licht- und Elektronenmikroskopie reduzieren wird empfohlen. Unter den verschiedenen speziellen Methoden Tokuyasu Cryo-Abschnitt Protokoll erfordert keine Austrocknung oder Harz einbetten und, darüber hinaus bewahrt die Antigenität von vielen Epitopen und bietet gute Gewebe Ultrastruktur8. Mehrere Methoden haben gezeigt, dass die Anwendbarkeit dieser Abschnitte in korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM)4,5,9,10.
Die Zebrafisch Netzhaut ist ein wertvolles Modell, visuelle Entwicklung und menschliche Krankheitsmechanismen angesichts seiner hoch konservierte Struktur und Funktion in Wirbeltieren zu studieren. In bestimmten, retinalen Photorezeptoren Display bestehend aus die gleiche Architektur als Säugetier Photorezeptoren mit einer basalen Synapse, ein Apico-basaler länglichen Kern, clustering von Mitochondrien in dem mehr apikalen innere und eine äußere Segment Membran Festplatten in den meisten apikale Position11. Protein-Lokalisierung, die vielfältigen zellulare Fächer ist zwischen Zebrafish konserviert und menschlich, so dass die Untersuchung der biologischen Funktion des menschlichen krankheitsrelevanten Proteinen12,13.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Larven Zebrafisch Vorbereitung Netzhaut Proben, die Lokalisierung der mitochondrialen Außenmembran Protein Tom20 korrelative Höchstauflösung Licht- und Elektronenmikroskopie zu lösen. Die Methode basiert auf das Sammeln von Cryo-Abschnitte auf Silizium-Wafer und Erlangung Kontrast durch topographische Informationen nach dem Auftragen einer dünnen Schicht aus Platin hergestellt. Diese Schritte sind klare technische Verbesserungen in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit, Reproduzierbarkeit und Zeit für Experimente. Wir haben vor kurzem die Anwendbarkeit der Methode zur Erkennung von Kernporen und mitochondrialen Proteine in Maus Gewebe14gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode verbindet super gelöst Protein Lokalisierung mit Kontextinformationen zu bestimmen, die genaue Position der Proteine in einer Organelle. Wir zeigen hier die Beendigung des Experiments, die Expression von Tom20 in der äußeren Membran der Mitochondrien und seine Beziehung zu anderen Organellen wie Kerne oder Außensegmenten der Sehzellen in der Netzhaut Larven Zebrafisch zu visualisieren.
Tokuyasu Cryo-Schneiden erfordert einige Übung, gut erhaltene Abschnitte zu erwerben. Dies ist jedoch eine Methode, die in vielen Laboratorien mit Erfolg21eingesetzt. Übertragung der Abschnitte auf dem Silizium-Wafer ist sehr einfach und benötigt keine besonderen Überlegungen. Die Verwendung von Glycerin in der bildgebenden Puffer ist ein sehr wichtiger Schritt um zu vermeiden, Trocknen der Abschnitte. Für Super-Resolution Imaging sind die besten Ergebnisse erzielt, wenn der Wafer in unmittelbarer Nähe der Glasboden der Petrischale befindet. Die Silikon-Streifen helfen Aufrechterhaltung des Wafers in dieser Position. Besonderer Sorgfalt ist geboten beim Entfernen der Streifen um die Abschnitte Schäden zu vermeiden.
Die Dicke der Cryo-Abschnitte, rund 100 nm, dünner als die optische Auflösung in der Z-Dimension, erleichtert zusätzlich die Genauigkeit dieser korrelativen Methode, wie die Super-Resolution-Mikroskopie-Signal nur diese dünne Schicht stammt und die Raster-Elektronenmikroskop Signal zeigt die Topografie der Probe. Diese Methode könnte auch mit mehrfarbigen Bildgebung kombiniert werden. Allerdings muss besondere Vorsicht geboten, dass die Probe unter gleichen Bedingungen (z. B. bildgebende Puffer) abgebildet kann und Übersprechen verhindert werden sollte.
Eine Einschränkung der Methode ist die zweidimensionale nähern, da nur eine begrenzte Anzahl von Schnittserien (ca. 3 bis 7 pro Wafer) gesammelt werden kann. Projekte zum Thema Volumen Analyse wäre so nicht ideal. Es ist jedoch eine Methode, die angewendet werden kann, um Protein-Expression in jede Art von Gewebe zu erkennen, durch einfaches Schneiden der Probe. Wir bieten eine Methode ohne Einsatz von klassischen Kontrastmittel wie Uranyl-Acetat oder Blei-Citrat. Der Kontrast von Platin Schattierung bietet sehr informativ topographischen Kontrast, aber in einigen Fällen Membranen sind schwer zu lösen. Dies kann Probleme für Projekte darstellen, die, zum Beispiel die Expression von Proteinen in kleinen Vesikeln zu bestimmen müssen.
Unser Protokoll basierend auf Tokuyasu Cryo-Abschnitte, nutzt Serienausstattung Höchstauflösung und Rasterelektronenmikroskope korrelative Ergebnisse erhalten. Die Sammlung von Abschnitten auf Silizium-Wafern und die Verwendung von Platin für Kontrast sind einfache Schritte, um Stabilität und Reproduzierbarkeit für die Probenvorbereitung.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanzierung von Ionen und RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione-SCORE zu gewähren, PZ00P3 142404/1 und PZ00P3 163979.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | #158127 | |
| Glutaraldehyde EM Grade | EMS, USA | #16220 | |
| Cacodylate | Merck | #8.20670 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
| Agarose, peqGOLD Universal | VWR International GmbH | 35-1020 | |
| Flat embedding molds | BEEM Flat | ||
| Local food brand gelatin | Dr.Oetker | Extra Gold | |
| Sucrose | Merck | #1.07687 | |
| Methylcellulose | Sigma | #M-6385 | |
| Glycine | Sigma | #G-7126 | |
| Gelatin type B | Sigma | #G-6650 | |
| BSA | Applichem | #A6588.0050 | |
| Silicon wafer | Si-Mat Silicon Materials | Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm | |
| Cryo-pin | Baltic Preparation | #16701950 | |
| Wired loop "Perfect loop" | |||
| Silicone stripes | Picodent | Twinsil 22 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
| glucoseoxidase | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | #C40 | |
| beta-Mercaptoethylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
| anti-Tom20 | Santa Cruz Biotechnology | #sc – 11415 | |
| AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
| DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
| Glycerol solution | Sigma-Aldrich | #49782 | |
| Glass bottom petri dish | Ibidi, Germany | u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158 | |
| SEM aluminium stub | Agar Scientific | #G301F | |
| Conducting carbon cement Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Diamond Knife (Cryo Immuno) | Diatome | DCIMM3520 | |
| Cryo-ultramicrotome | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
| Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
| 160x 1.43 TIRF objective | Leica Microsystems | 11523048 | |
| SEM – Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
| FIB-SEM – Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |
References
- Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities. Chem Rev. , (2017).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Fölling, J., Bossi, M., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy. PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).
- Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Suleiman, H., Zhang, L., et al. Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane. eLife. 2, e01149 (2013).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking. Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).
- Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking. PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).
- Mateos, J. M., Guhl, B., et al. Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy. Sci Rep. 6, 34062 (2016).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., Saalfeld, S., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).
- Wurm, C. A., Neumann, D., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).
