質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製
Summary
RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA 結合領域をマップするためのプロトコルについて述べる。
Abstract
Rna は、遺伝子発現、クロマチン構造と DNA 修復を規制を含むいくつかの核プロセスで重要な役割を果たします。ほとんどの場合、非翻訳 Rna のアクションは蛋白質の機能が Rna とこれらの相互作用によって規制されて順番によって媒介されます。これと一致して、増えて核機能に関与するタンパク質の RNA をバインドする報告されているし、いくつかのケースでこれらの蛋白質の RNA 結合領域マップされている、多くの場合骨の折れる、候補者ベースのメソッドを使用します。
ここで、RNA 結合タンパク質と RNA 結合領域の高スループット、プロテオーム的公平な識別を実行する詳細なプロトコルを報告します。方法論は、光反応性ウリジン細胞 RNA、蛋白・ RNA の UV を介した架橋と質量分析に続いて、プロテオーム内 RNA 架橋ペプチドを明らかにするためにアナログの取り込みに依存しています。マウス胚性幹細胞のための手順を説明する、プロトコルは、簡単にさまざまな培養細胞に適応する必要があります。
Introduction
RBR ID メソッドの目的は、新規 RNA 結合タンパク質 (Rbp) を識別し、RNA 結合変異体のデザインと生物学的・生化学的研究を促進するペプチド レベルの解像度とその RNA 結合領域 (RBRs) を割り当てるには蛋白質と核酸の相互作用の機能。
RNA は、遺伝情報を運ぶメッセンジャーとして行動することができも折る蛋白質1,2のものに似ている生化学的機能を持つ複雑な三次元構造、生体分子間で一意です。証拠の成長するボディは、Rna (ncRNAs) は様々 な遺伝子規制およびエピジェネティックな経路3,4,5で重要な役割を果たすし、コンサートでこれらの規定する機能を仲介する通常、示唆しています。具体的には特定の RNA と相互作用する蛋白質。特定の関連性の相互作用の蛋白質のセットは激しく勉強長い ncRNA (lncRNA) この lncRNA が女性の細胞6,7 における x 染色体不活性化に仲介する貴重な洞察を提供する Xist の最近確認されました。 ,8。とりわけ、Xist と相互作用するタンパク質のいくつかの標準的な RNA 結合ドメイン9が含まれていない、したがって、RNA 結合活性予測できなかったインシリコ単独で主なシーケンスに基づいています。LncRNAs の何千もが任意の特定のセルの10で表されることを考えると、それは、それらの多くを RNA 結合タンパク質 (Rbp) が発見される、まだ行動との相互作用を介して可能性がありますと仮定するが妥当。これらの新しい Rbp を識別する実験的戦略 ncRNAs の生物学的機能のタスクが大いに促進したがって。
経験的 Rbp を識別する以前の試みは、polyA + 質量分析法 (MS)11,12,13,14,15と結合した RNA 選択に頼ってきました。これらの実験は、デザイン polyadenylated 成績証明書にバインドされているタンパク質を検出できるだけで推定 Rbp のリストに多くの蛋白質を追加。ただし、ほとんどの小さな Rna と多くの lncRNAs は polyadenylated ではありません。16,17との相互作用の蛋白質が可能性が見逃しているこれらの実験で。最近の研究では、複数の知られている Rbp と精製には共同、これら再発 RBP パートナーの RNA 結合活動18を持っている可能性が高いを示した蛋白質を識別するタンパク質インタラクトーム データベースに機械学習を適用されます。ただし、この方法は、既存の大規模な相互作用データベースのマイニングに依存し、共同知られている Rbp、不溶性、膜に埋め込まれて、希少な解析から除いたと非変化条件で精製することができます蛋白質を識別することができますのみ蛋白質。
しばしばbona fide RBP としてタンパク質の同定はタンパク質-RNA 相互作用の生物学的・生化学的機能に関する情報を自動的に生成しません。この点に対処するため、それは通常各小説 RBP19、のコンテキストで RNA 結合の関数をテストする特定の変異体を設計できますように蛋白質のドメインとアミノ酸の相互作用に関与する残渣を識別することが望ましい20. 私達のグループと他の前の努力は RNA 結合領域 (RBRs)19,20,21,22; を識別する組換えタンパク質断片と欠失変異株を使用しています。ただし、このようなアプローチは手間と高スループット解析と互換性がありません。最近では、研究が質量23; を使用して高スループット方法で RNA 結合アクティビティにマップする実験的戦略を説明ただし、このアプローチはダブル polyA + RNA 選択に頼った、従って上記 RBP 同定アプローチと同じ制限を実施します。
光架橋蛋白質 RNA と蛋白質とことがなく生細胞における RNA と相互作用するタンパク質領域を識別するために定量的質量分析を利用する RNA 結合領域識別 (RBR-ID) と呼ばれる手法を開発RNA の起こる状況を想定、こうして Rbp を含む polyA Rna24にバインドされています。また、このメソッドは架橋に専ら依存しているとタンパク質溶解度またはユーザー補助の要件を持たないし、膜 (例えば核封筒) または難溶性コンパートメント (内 RNA 結合アクティビティをマッピングに最適です。例えば核マトリックス)。マウス胚性幹細胞 (mESCs) の核の RBR ID の実験手順について述べるが、マイナーな修正とこのプロトコルに適しているべき様々 な細胞の種類、彼らは効率的に文化から 4SU を組み込むことができますされます。媒体。
Protocol
Representative Results
Discussion
MESCs と、4SU の RNA を組み込むことができます任意のセルに、適切な修正と RBR ID を実行する詳細な実験的プロトコルについて述べる。他の細胞型は、十分な信号対雑音比を確実にとる方法の最適化を必要があります。さらに、プロトコルは、核 Rbp の検討に焦点を当ててを記載、一方 RBR ID 技術は異なる分別法による細胞質または特定の細胞小器官などの異なる細胞コンパートメントに容易に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R. b. は、サール学者プログラム、大戦スミス財団 (C1404) および (1-年度-15-344) ・ ダイムズ財団の 3 月によって支えられました。:Wii は、NIH からのサポートは R01GM110174 と NIH の R01AI118891 を付与し、DOD、BC123187P1 を付与を認めています。R. W. T.NIH のトレーニングの許可 T32GM008216 によって支えられました。
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
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