إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق
Summary
يصف لنا وضع بروتوكول لتحديد البروتينات ملزم الجيش الملكي النيبالي ورسم خريطة مناطقها ربط الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية باستخدام فوتوكروسلينكينج بوساطة الأشعة فوق البنفسجية والطيف الكتلي.
Abstract
الكشف فضله تلعب أدواراً هامة في العديد من العمليات النووية، بما في ذلك تنظيم التعبير الجيني وهيكل الكروماتين، وإصلاح الحمض النووي. وفي معظم الحالات، هو عمل الكشف فضله توسط البروتينات التي تتمثل مهامها في دورة تنظمها هذه التفاعلات مع الكشف فضله. وتمشيا مع هذا، أفيد أن عددا متزايداً من البروتينات المشاركة في المهام النووية ربط الحمض النووي الريبي، وفي بعض الحالات مناطق ربط الحمض النووي الريبي هذه البروتينات تم تعيينها، غالباً من خلال طرق شاقة، على أساس المرشح.
هنا، نحن تقرير بروتوكول مفصل لأداء بطاقة هوية غير متحيزة الفائق، والبروتين على نطاق المنظومة الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات ومناطقها ربط الحمض النووي الريبي. المنهجية تعتمد على إدماج uridine فوتوريكتيفي التناظرية في الرنا الخلوية، تليها crosslinking البروتين بوساطة الأشعة فوق البنفسجية-الجيش الملكي النيبالي، وتحليل الطيف الكتلي لتكشف عن الجيش الملكي النيبالي كروسلينكيد الببتيدات داخل البروتين. على الرغم من أننا تصف الإجراءات المتعلقة بالخلايا الجذعية الجنينية الماوس، ينبغي تكييف البروتوكول بسهولة إلى مجموعة متنوعة من الخلايا المستزرعة.
Introduction
وغرض الأسلوب RBR-معرف هو تحديد رواية الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) وخريطة مناطقها ربط الحمض النووي الريبي (ربرس) مع القرار مستوى الببتيد لتسهيل تصميم طفرات الحمض النووي الريبي الملزمة، والتحقيق في البيولوجية والبيوكيميائية وظائف لتفاعلات البروتين-الجيش الملكي النيبالي.
الحمض النووي الريبي فريدة من نوعها بين الجزيئات الحيوية يمكن على حد سواء بمثابة رسول يحمل المعلومات الوراثية وإضعاف أيضا في هياكل ثلاثية الأبعاد المعقدة مع الوظائف البيوكيميائية أشبه بتلك البروتينات1،2. مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن الكشف فضله (نكرناس) تلعب أدواراً هامة في مختلف الجينات مسارات تنظيمية وجينيه،3،4،5 ، وعادة، وساطة هذه المهام التنظيمية في الحفل مع البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي الريبي معين على وجه التحديد. أهمية خاصة، مؤخرا تم تحديد مجموعة من البروتينات المتفاعلة لنكرنا طويلة درس مكثف (لنكرنا) زيست، توفير نظرة ثاقبة قيمة كيف يتوسط لنكرنا هذه المنظمة إكستشروموسومي في خلايا الإناث6،7 ،8. جدير بالذكر أن العديد من هذه البروتينات زيست التفاعل لا تحتوي على أي المجالات الملزمة الجيش الملكي النيبالي9المتعارف عليه، ولذلك لا يمكن أن يكون نشاطهم الحمض النووي الريبي الملزمة المتوقعة في السيليكون استناداً إلى تسلسل الأولية بها وحدها. وبالنظر إلى أن آلاف لنكرناس يتم التعبير عنها في أي خلية معينة10، فمن المعقول أن نفترض أن العديد منهم قد تتصرف عن طريق التفاعلات مع بعد أن اكتشف الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية). ولذلك سيسهل استراتيجية تجريبية لتحديد هذه الممارسات التجارية التقييدية رواية مهمة تشريح الوظيفة البيولوجية نكرناس.
اعتمدت المحاولات السابقة لتحديد الممارسات التجارية التقييدية تجريبيا على الحمض النووي الريبي التحديد بوليا + بالإضافة إلى الطيف الكتلي (مللي ثانية)11،،من1213،،من1415. على الرغم من أن هذه التجارب إضافة العديد من البروتينات إلى قائمة المفترضة الممارسات التجارية التقييدية، حسب التصميم هم من الكشف عن بروتينات ملزمة للنصوص بوليادينيلاتيد فقط. ومع ذلك، معظم الكشف الصغيرة والعديد من لنكرناس لا بوليادينيلاتيد. 16 , 17 وعلى البروتينات المتفاعلة، وأن المرجح أن قد ضاعت في هذه التجارب. دراسة أجريت مؤخرا تطبيق التعلم آلة للبروتين-بروتين إينتيراكتومي قواعد البيانات لتحديد البروتينات التي تنقية يشترك مع الممارسات التجارية التقييدية المعروفة متعددة وأظهرت أن هؤلاء الشركاء الممارسات التجارية التقييدية المتكررة أكثر تعرضا لامتلاك الجيش الملكي النيبالي-ربط أنشطة18. بيد أن هذا النهج يعتمد على التعدين قواعد البيانات الموجودة بتفاعل كبير ويمكن فقط تحديد البروتينات التي يمكن تنقية شاركت في ظروف غير يشوه مع الممارسات التجارية التقييدية معروفة، وبالتالي تستبعد من التحليل غير قابلة للذوبان، وجزءاً لا يتجزأ من الغشاء، وندرة البروتينات.
تحديد البروتين ك حسن النية الممارسات التجارية التقييدية كثيرا ما لا تؤدي تلقائياً معلومات عن الوظيفة البيولوجية و/أو الكيميائية الحيوية للتفاعل البروتين-الجيش الملكي النيبالي. لمعالجة هذه النقطة، من المستحسن عادة تحديد البروتين من الأحماض الأمينية والمجال المخلفات تشارك في التفاعل بحيث يمكن تصميم طفرات محددة لاختبار وظيفة ربط الحمض النووي الريبي في سياق رواية كل الممارسات التجارية التقييدية19، 20-الجهود السابقة من مجموعتنا وغيرها استخدمت شظايا البروتين المؤتلف وطفرات الحذف لتحديد الحمض النووي الريبي ربط المناطق (ربرس)19،20،،من2122؛ مثل هذا النهج غير كثيفة العمالة ويتنافى مع التحليلات الفائق. في الآونة الأخيرة، وصفت دراسة استراتيجية تجريبية لخريطة الأنشطة الملزمة الجيش الملكي النيبالي بطريقة الفائق باستخدام الطيف الكتلي23؛ بيد أن هذا النهج يعتمد على تشكيلة بوليا مزدوجة + الجيش الملكي النيبالي وثم قام نفس قيود اقتراب تحديد الممارسات التجارية التقييدية المذكورة أعلاه.
قمنا بتطوير تقنية، ووصف الجيش الملكي النيبالي ملزمة المنطقة تحديد الهوية (معرف RBR)، الذي يستغل فوتوكروسلينكينج البروتين-الجيش الملكي النيبالي والكمية الكتلي للتعرف على البروتينات والبروتين مناطق التفاعل مع الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية دون صنع وبالتالي بما في ذلك الممارسات التجارية التقييدية الافتراض في حالة بوليادينيليشن الجيش الملكي النيبالي، ملزمة بالكشف بوليا24. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب تعتمد حصرا على كروسلينكينج وليس لديها مطالب على الذوبان في البروتين أو إمكانية الوصول وهو بالتالي مناسبة لتعيين أنشطة الجيش الملكي النيبالي ملزمة داخل الأغشية (مثلاً المغلف النووية) أو (مقصورات ضعيفة الذوبان مثلاً المصفوفة النووية). نحن تصف الخطوات التجريبية لتنفيذ RBR-معرف لنواة الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ميسكس) ولكن مع إدخال تعديلات طفيفة عليها ينبغي أن يكون هذا البروتوكول مناسبة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، شريطة أن أنها يمكن أن تتضمن كفاءة 4SU من الثقافة المتوسطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكننا وصف بروتوكول تجريبي مفصلة لأداء RBR-معرف في ميسكس، ومع إدخال التعديلات المناسبة، في أي خلية يمكن دمج 4SU في الجيش الملكي النيبالي. أنواع خلايا أخرى قد تتطلب التحسين النهج لضمان إشارة كافية إلى نسبة الضوضاء. بالإضافة إلى ذلك، بينما وصف البروتوكول هنا يركز على دراسة الممارسات التجارية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
سنغ أيده البرنامج علماء سيرل، ومؤسسة سميث قد (C1404)، وفي آذار/مارس من الدايمات مؤسسة (1-السنة المالية-15-344). وتسلم B.A.G منح دعم من المعاهد الوطنية للصحة R01GM110174 و R01AI118891 المعاهد الوطنية للصحة، فضلا عن وزارة الدفاع منح BC123187P1. رو-ت. وأيد منح التدريب في المعاهد الوطنية للصحة T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3′ ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5′ splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
