Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA
Summary
Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.
Abstract
RNA não-codificante desempenham papéis importantes em diversos processos nucleares, incluindo a regulação da expressão gênica, estrutura da cromatina e reparação do DNA. Na maioria dos casos, a ação de RNA não-codificante é mediada por proteínas que por sua vez, cujas funções são regulamentadas por essas interações com RNA não-codificante. Consistente com este, um número crescente de proteínas envolvidas em funções nucleares têm sido relatado para vincular o RNA e em alguns casos as regiões de RNA-ligação destas proteínas foram mapeadas, muitas vezes através de métodos laboriosos, baseado no candidato.
Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado para realizar uma identificação imparcial elevado-throughput, proteoma-largo de RNA-proteínas e suas regiões de RNA-obrigatórias. A metodologia baseia-se na incorporação de uma uridina fotorreativas analógica no RNA celular, seguido de reticulação de RNA-proteína mediada por UV e análises de espectrometria de massa para revelar o RNA-quitosana péptidos dentro do proteoma. Embora nós descrevemos o procedimento para as células estaminais embrionárias de rato, o protocolo deve ser facilmente adaptado a uma variedade de culturas de células.
Introduction
O objetivo do método RBR-ID é identificar novas proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) e mapear as regiões de RNA-obrigatórias (RBRs) com resolução de peptídeo-nível para facilitar o design de mutantes de RNA-obrigatórias e a investigação da biológicas e bioquímicas funções de interações proteína-RNA.
O RNA é único entre biomoléculas pode atuar como um mensageiro carregando informação genética e também dobrar em estruturas tridimensionais complexas com funções bioquímicas mais parecidas com as de proteínas1,2. Um corpo crescente de evidências sugere que o RNA não-codificante (ncRNAs) desempenhar um papel importante em diversos genes vias regulamentares e epigenéticas3,4,5 e, normalmente, essas funções reguladoras são mediadas em concerto com proteínas que interagem especificamente com um determinado RNA. De particular importância, um conjunto de proteínas de interação foi recentemente identificado para o ncRNA longo intensamente estudada (lncRNA) Xist, fornecendo insights valiosos sobre como este lncRNA Medeia a inativação do cromossomo x em células femininas6,7 ,8. Notavelmente, várias destas proteínas Xist-interagindo não contêm qualquer de domínios de RNA-ligação canônica9, e, portanto, sua atividade RNA-ligação não poderia ser previsto em silico com base em sua sequência primária sozinha. Considerando que milhares de lncRNAs são expressos em qualquer determinada célula10, é razoável supor que muitos deles podem agir através de interações com o ainda a ser descoberto proteínas RNA-obrigatórias (RBPs). Uma estratégia experimental para identificar essas novela RBPs, portanto, iria facilitar grandemente a tarefa de dissecar a função biológica de ncRNAs.
Tentativas anteriores para identificar RBPs empiricamente têm invocado polyA + RNA seleção acoplada a espectrometria de massa (MS)11,12,13,14,15. Embora estas experiências adicionado muitas proteínas à lista do RBPs putativos, por design, que só podiam detectar proteínas vinculadas a polyadenylated transcrições. No entanto, a maioria dos RNAs pequeno e muitos lncRNAs não são polyadenylated. 16 , 17 e suas proteínas de interação teria provavelmente sido perdidas nesses experimentos. Um estudo recente da proteína-proteína interactome bancos de dados para identificar as proteínas que co purificado com vários conhecidos RBPs e mostraram que esses parceiros RBP recorrentes eram mais prováveis de possuir RNA-obrigatórias atividades18aplicada aprendizado de máquina. No entanto, essa abordagem baseia-se na mineração de bancos de dados existentes de grande interação e só podemos identificar as proteínas que podem ser co purificadas em condições não-desnaturação com conhecidos RBPs, excluindo assim a partir da análise, insolúvel, membrana-incorporado e escassa proteínas.
A identificação de uma proteína como uma bona fide RBP muitas vezes não produz automaticamente informações sobre a função biológica e/ou bioquímica da interação da proteína-RNA. Para resolver este ponto, é geralmente desejável para identificar os proteína domínio amino-ácido resíduos e envolvidos na interação, para que os mutantes específicos podem ser projetados para testar a função de ligação de RNA no contexto de cada novela RBP19, 20. esforços anteriores do nosso grupo e outros usaram fragmentos de proteína recombinante e exclusão mutantes para identificar RNA vinculação regiões (RBRs)19,20,21,22; no entanto, tais abordagens são trabalhosas e incompatível com as análises de alta produtividade. Mais recentemente, um estudo descreveu uma estratégia experimental para mapear as atividades de RNA-obrigatórias em uma moda de alta produtividade usando espectrometria de massa23; no entanto, esta abordagem baseou-se em uma seleção duplo polyA + RNA e assim, carregava as mesmas limitações que as abordagens de identificação RBP descritas acima.
Desenvolvemos uma técnica, denominada RNA vinculação região identificação (RBR-ID), que explora a proteína-RNA photocrosslinking e espectrometria de massa quantitativa para identificar proteínas e regiões da proteína interagindo com RNA em células vivas sem fazer suposição sobre o estatuto de poliadenilação RNA, incluindo assim RBPs vinculado a polyA-RNAs24. Além disso, esse método depende exclusivamente de reticulação e tem sem requisitos na solubilidade de proteínas ou acessibilidade e, portanto, é adequado para mapear as atividades de RNA-obrigatórias dentro membranas (por exemplo, o envelope nuclear) ou compartimentos pouco solúvel ( por exemplo, a matriz nuclear). Descrevemos as etapas experimentais para executar RBR-ID para os núcleos de células estaminais embrionárias de rato (mESCs), mas com pequenas modificações este protocolo deve ser apropriado para uma variedade de tipos de células, desde que eles eficientemente podem incorporar 4SU da cultura médio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descreveremos um protocolo experimental pormenorizado para executar RBR-ID em mESCs e, com modificações apropriadas, em qualquer célula que pode incorporar 4SU em RNA. Outros tipos de células podem exigir a otimização da abordagem para garantir um suficiente sinal à relação de ruído. Além disso, enquanto o protocolo descrito neste documento concentra-se no exame do RBPs nucleares, a tecnologia de RBR-ID deve ser facilmente adaptada para diferentes compartimentos celulares, como o citoplasma ou organelas espec?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. foi apoiada pelo programa de estudiosos de Searle, Fundação Smith W.W. (C1404) e a marcha de Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconhece que o apoio do NIH concede R01GM110174 e NIH R01AI118891, bem como DOD conceder BC123187P1. R.W. ‘-T. foi apoiada pelo subsídio de formação de NIH T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
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