Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions
Summary
Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.
Abstract
RNA non codificanti svolgono i ruoli importanti in diversi processi nucleari, tra cui che regolano l’espressione genica, struttura della cromatina e riparazione del DNA. Nella maggior parte dei casi, l’azione di RNA non codificante è mediato dalle proteine le cui funzioni sono a loro volta regolate da queste interazioni con RNA non codificanti. Coerentemente con questo, un numero crescente di proteine coinvolte in funzioni nucleari è stato segnalato per legare RNA e in alcuni casi le regioni di RNA-binding di queste proteine sono state mappate, spesso attraverso metodi laboriosi, basati su candidati.
Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato per eseguire un’alto-rendimento, tutto il proteoma imparziale identificazione di proteine RNA-leganti e le loro regioni di RNA-binding. La metodologia si basa sull’incorporazione di un uridina fotoreattivo analogico in RNA cellulare, seguito da reticolazione UV-mediata della proteina-RNA e analisi di spettrometria di massa per rivelare RNA-reticolato peptidi all’interno del proteoma. Anche se Descriviamo la procedura per cellule staminali embrionali di topo, il protocollo deve essere facilmente adattato ad una varietà di cellule coltivate.
Introduction
Lo scopo del metodo RBR-ID è di identificare nuove proteine RNA-leganti (RBPs) e mappare le loro regioni di RNA-binding (RBRs) con risoluzione di peptide-livello per facilitare la progettazione di mutanti di RNA-binding e l’indagine del biologico e biochimico funzioni delle interazioni della proteina-RNA.
il RNA è unica tra le biomolecole come può agire come un messaggero che trasportano informazioni genetiche sia anche piegare in complesse strutture tridimensionali con funzioni biochimiche più simili a quelle di proteine1,2. Un corpo crescente di prova suggerisce che il RNA non codificante (ncRNAs) svolgono un ruolo importante in vari gene vie regolamentazione ed epigenetici3,4,5 e, in genere, queste funzioni di regolamentazione sono mediate in concerto con proteine che interagiscono specificamente con un determinato RNA. Di particolare rilevanza, recentemente è stato identificato un insieme di proteine che interagiscono per il ncRNA lungo intensamente studiato (lncRNA) Xist, fornendo informazioni preziose in come questo lncRNA media inattivazione del cromosoma x in cellule femminili6,7 ,8. In particolare, molte di queste proteine interagenti Xist non contengono alcun canonico RNA-binding domini9, e quindi loro attività RNA-binding non poteva essere previsto in silico basata alla loro sequenza primaria da solo. Considerando che migliaia di lncRNAs è espressi in qualsiasi data cellula10, è ragionevole presumere che molti di loro potrebbe agire tramite interazioni con ancora di essere scoperto le proteine RNA-leganti (RBPs). Una strategia sperimentale per identificare queste RBPs romanzo sarebbe pertanto facilitare notevolmente il compito di sezionare la funzione biologica di ncRNAs.
Precedenti tentativi di identificare RBPs empiricamente si affidano di polyA + RNA selezione accoppiata a spettrometria di massa (MS)11,12,13,14,15. Anche se questi esperimenti aggiunto molte proteine alla lista dei presunti RBPs, da design che potrebbe rilevare solo proteine legate alle trascrizioni di poliadenilazione. Tuttavia, la maggior parte dei piccoli RNA e molti lncRNAs non sono poliadenilazione. 16 , 17 e le loro proteine interagenti sarebbero probabilmente stati mancati in questi esperimenti. Un recente studio applicato apprendimento automatico ai database Interactoma proteina-proteina per identificare le proteine che co-purificato con più noto RBPs e ha mostrato che questi partner RBP ricorrenti erano più probabili di possedere attività di legame al RNA18. Tuttavia, questo approccio si basa sul database di grande interazione esistenti di data mining e può identificare solo proteine che possono essere co-purificate in condizioni di non-denaturante con RBPs noti, così escludendo dall’analisi insolubile, membrana incorporato e scarse proteine.
L’identificazione di una proteina come una bona fide RBP spesso non produce automaticamente informazioni sulla funzione biologica e/o biochimica dell’interazione proteina-RNA. Per risolvere questo punto, è in genere appropriato per identificare i residui proteici dell’aminoacido e dominio coinvolti nell’interazione, in modo che mutanti specifici possono essere progettati per testare la funzione di legame al RNA nel contesto di ogni romanzo RBP19, 20. gli sforzi precedenti dal nostro gruppo e altri hanno utilizzato frammenti della proteina ricombinante e mutanti di delezione per identificare RNA binding regioni (RBRs)19,20,21,22; Tuttavia, tali approcci sono laboriosi e incompatibile con le analisi di alto-rendimento. Più recentemente, uno studio descritto una strategia sperimentale per mappare attività RNA-binding a una moda di alto-rendimento mediante spettrometria di massa23; Tuttavia, questo approccio invocata una selezione doppia polyA + RNA e così ha trasportato le stesse limitazioni di RBP identificazione approcci descritti sopra.
Abbiamo sviluppato una tecnica, denominata identificazione di regione di associazione di RNA (RBR-ID), che sfrutta la proteina-RNA photocrosslinking e quantitativa spettrometria di massa per identificare proteine e regioni della proteina che interagiscono con il RNA in cellule vive senza fare assunta lo stato di poliadenilazione di RNA, includendo così RBPs associato a polyA-RNAs24. Inoltre, questo metodo si basa esclusivamente sulla reticolazione e non prevede alcun requisito sulla solubilità della proteina o accessibilità ed è quindi adatto per mappare attività RNA-binding all’interno di membrane (ad es. l’involucro nucleare) o compartimenti scarsamente solubili ( ad esempio la matrice nucleare). Descriviamo la procedura sperimentale per eseguire RBR-ID per i nuclei delle cellule staminali embrionali di topo (mESCs) ma con modifiche minori questo protocollo dovrebbe essere adatto per una varietà di tipi cellulari, purché essi possono incorporare efficientemente 4SU dalla cultura medio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un protocollo sperimentale dettagliato per eseguire RBR-ID in mESCs e, con opportune modifiche, in qualsiasi cella che può incorporare 4SU in RNA. Altri tipi di cellule possono richiedere ottimizzazione dell’approccio per garantire un sufficiente rapporto segnale-rumore. Inoltre, mentre il protocollo descritto nel presente documento si concentra sull’esame di RBPs nucleare, la tecnologia di RBR-ID dovrebbe essere facilmente adattata a diversi compartimenti cellulari, ad esempio il citosol o organelli specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. è stato sostenuto dal programma studiosi Searle, la W.W. Smith Foundation (C1404) e il March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G riconosce sostegno da NIH sovvenzioni R01GM110174 e R01AI118891 NIH, così come DOD concedere BC123187P1. R.W.-T. è stato sostenuto da grant di formazione NIH T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
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