Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов
Summary
Мы описываем протокол для определения RNA-связывая протеинов и сопоставления их RNA-связывая регионов в живых клеток с помощью УФ опосредованной photocrosslinking и масс-спектрометрии.
Abstract
Некодирующей РНК играют важную роль в нескольких ядерных процессов, включая регулирование экспрессии генов, Структура хроматина и репарации ДНК. В большинстве случаев действий некодирующей РНК при посредничестве белки, функции которого, в свою очередь регулируются эти взаимодействия с некодирующей РНК. В соответствии с этим все большее количество белков, участвующих в ядерной функции были зарегистрированы для связывания РНК и в нескольких случаях были сопоставлены RNA-связывая регионах этих белков, часто через кропотливого, кандидат на основе методов.
Здесь мы приводим подробный протокол для выполнения высокой пропускной способностью, протеома общесистемной объективной идентификации RNA-связывая протеинов и их RNA-связывая регионов. Методология опирается на включение photoreactive уридина аналоговый в клеточной РНК, следуют сшивки УФ опосредованной белка РНК и масс-спектрометрии анализа выявить РНК сшитый пептидов в пределах протеома. Хотя мы описываем порядок мышиных эмбриональных стволовых клеток, протокол должен быть легко адаптирована к различным культивируемых клеток.
Introduction
ППР-ID метод предназначен для выявления роман RNA-связывая протеинов (ОДП) и сопоставить их RNA-связывая регионов (RBRs) с резолюцией пептид уровне для облегчения разработки RNA-связывая мутантов и расследование биологические и биохимические функции взаимодействия протеин РНК.
РНК является уникальной среди биомолекул, как он может выступать в качестве посыльного, перевозящих генетической информации и также сложить в сложных трехмерных структур с биохимические функции больше сродни тем белки1,2. Растущее количество доказательств свидетельствует о том, что некодирующей РНК (ncRNAs) играют важную роль в различных генов регулирования и эпигеномные пути3,4,5 , и, как правило, эти функции регулирования являются посредниками в концерте с белками, которые взаимодействуют непосредственно с данной РНК. Особое значение был недавно определен набор взаимодействующих белков для интенсивно изучали долго ncRNA (lncRNA) Xist, предоставляя ценную информацию о как этот lncRNA является посредником инактивации х в женских клетки6,7 ,8. Примечательно некоторые из этих взаимодействующих Xist белков не содержат любой канонические RNA-связывая доменов9, и поэтому их деятельность РНК привязки не может быть предсказано в silico на основе их первичной последовательности только. Учитывая, что тысячи lncRNAs выражаются в любой заданной ячейки10, это разумно предположить, что многие из них могут действовать через взаимодействие с еще предстоит открыть RNA-связывая протеинов (ОДП). Поэтому экспериментальные стратегии для выявления этих Роман ОДП значительно облегчит задачу рассекает биологической функции ncRNAs.
Предыдущие попытки выявления ОДП эмпирически полагались на поля + РНК отбора в сочетании с масс-спектрометрия (МС)11,12,13,14,15. Хотя эти эксперименты многие белки добавляется в список предполагаемых ОДП, Дизайн они могут только обнаружить белки, привязан к polyadenylated стенограммы. Однако большинство малых РНК и многие lncRNAs не являются polyadenylated. 16 , 17 и их взаимодействия белков было бы вероятно пропустили в этих экспериментах. Недавнее исследование применяется машинного обучения для белок белковых interactome баз данных для идентификации белков, которые совместно очищается с несколькими известными ОДП и показал, что эти периодические ОДП партнеры были более склонны обладают RNA-связывая деятельности18. Однако этот подход основывается на добыче существующих крупных взаимодействия баз данных и может идентифицировать только белки, которые могут быть совместно очищенный в условиях денатурации с известными ОДП, исключая, таким образом, из анализа нерастворимые, встраиваемый мембраны и дефицитных белки.
Определение белка как bona fide ОДП часто автоматически не дают информацию на биологические и биохимические функции взаимодействия протеин РНК. Для решения этой точки, обычно желательно определить белка домен аминокислотных остатков и участвующие во взаимодействии, так что конкретные мутанты могут быть разработаны для тестирования функции связывания РНК в контексте каждого романа ОДП19, 20. предыдущие усилия нашей группы и другие использовали фрагменты рекомбинантных белков и удаления мутантов для определения РНК привязки регионов (RBRs)19,20,,2122; Однако такие подходы являются трудоемкие и несовместимы с высок объём анализы. Совсем недавно исследование описал экспериментальный стратегию для сопоставления RNA-связывая деятельности в духе высокой пропускной способности, с помощью масс-спектрометрии23; Однако этот подход опирался на выбор двойной поля + РНК и таким образом осуществляется те же ограничения, что описанных выше подходов идентификации ОДП.
Мы разработали метод, называется РНК привязки региона идентификации (ППР-ID), который эксплуатирует photocrosslinking белка РНК и количественного масс-спектрометрии для идентификации белков и белка регионов, взаимодействующих с РНК в живых клеток без делать предположение о статусе сплайсингу РНК, таким образом включая ОДП неизбежно поля РНК24. Кроме того этот метод опирается исключительно на сшивки и имеет никаких требований на растворимость белков или доступность и таким образом подходит для сопоставления RNA-связывая мероприятий в рамках мембран (например ядерная оболочка) или отсеки малорастворимых ( например ядерной матрицы). Мы описывают экспериментальные шаги для выполнения ППР-ID для ядер мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), но с незначительными изменениями этот протокол должен быть подходящим для различных типов клеток, при том условии, что они могут эффективно включать 4СУ от культуры Средний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем подробный экспериментальный протокол для выполнения ППР-ID в mESCs и, с соответствующими изменениями, в любой ячейке, которое может включать 4СУ в РНК. Другие типы клеток может потребоваться оптимизация подхода для обеспечения достаточной соотношение сигнал-шум. Кроме того в ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Р.б. была поддержана программа ученых Searle, W.W. Смит фонд (C1404) и марта Dimes фонда (1-FY-15-344). Ягдташ признает поддержку от НИЗ предоставляет R01GM110174 и R01AI118891 низ, а также мо предоставить BC123187P1. Р.У.-Т. была поддержана NIH обучения Грант T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3′ ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5′ splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
