הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים
Summary
אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.
Abstract
Noncoding RNAs תפקיד חשוב בתהליכים גרעיניים מספר, לרבות ויסות גנים, הכרומטין ו- DNA לתקן. ברוב המקרים, הפעולה של noncoding RNAs מתווך על ידי פונקציות אשר בתורו מוסדרים על ידי אינטראקציות אלה noncoding RNAs עם חלבונים. בקנה אחד עם זה, מספר גדל והולך של החלבונים המעורבים פונקציות גרעיני דווח לאגד RNA, במקרים אחדים האזורים RNA-איגוד של חלבונים אלו שמופו, לעיתים קרובות באמצעות שיטות מפרך, המבוססים על המועמד.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט לביצוע זיהוי מוטים תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב של RNA-מחייב חלבונים ואזורים מחייב RNA שלהם. המתודולוגיה מתבססת על שילוב של uridine photoreactive אנלוגי ב- הסלולר RNA, ואחריו crosslinking בתיווך UV חלבון-RNA, וניתוחים ספקטרומטר מסה לחשוף RNA-תפור פפטידים בתוך פרוטאום. אמנם אנו מתארים את ההליך עבור תאי גזע עובריים בעכבר, הפרוטוקול צריך ניתן להתאים בקלות במגוון של תאים בתרבית.
Introduction
מטרת השיטה RBR-ID היא כדי לזהות רנ א מחייב הרומן חלבונים (RBPs) מפת אזורים מחייב RNA שלהם (RBRs) עם פפטיד ברמת רזולוציה כדי להקל על העיצוב של RNA-איגוד מוטציות והחקירה של הביולוגי, הביוכימי פונקציות של אינטראקציות חלבון-RNA.
רנ א היא ייחודית בין מולקולות כמו זה יכול גם לשמש שליח נושא מידע גנטי וגם גם לקפל לתוך מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם ביוכימיות פונקציות יותר דומה לאלה של חלבונים1,2. גוף גדל והולך של ראיות מרמז כי noncoding RNAs (ncRNAs) תפקיד חשוב שונים ג’ין מסלולים epigenetic ולניהולו4,3,5 , בדרך כלל, פונקציות רגולטוריות אלו הם מתווכת בהופעה עם חלבונים המקיימים אינטראקציה באופן ספציפי עם RNA נתון. הרלוונטיות, קבוצה של חלבונים שמעצבת זוהה לאחרונה עבור ncRNA זמן ובאינטנסיביות למדה (lncRNA) Xist, מתן ערך תובנה איך lncRNA זו שמתווכת שמושרש איון הנשי תאים6,7 ,8. ראוי לציין, מספר חלבונים אלה אינטראקציה-Xist אינם מכילים כל התחומים הקנוני RNA מחייב9, ולכן הפעילות מחייב RNA שלהם לא יכול להיות החזוי סיליקו בהתבסס על הרצף העיקרי שלהם לבד. בהתחשב בכך כי אלפי lncRNAs באים לידי ביטוי בכל תא נתון10, סביר להניח כי רבים מהם עשוי לפעול באמצעות אינטראקציות עם עדיין מתגלים RNA מחייב חלבונים (RBPs). אסטרטגיית ניסיוני לזהות את אלה RBPs הרומן ולכן להקל במידה רבה על המשימה של לנתח את תפקוד ביולוגי ncRNAs.
ניסיונות קודמים כדי לזהות RBPs מדעית צריכים לסמוך על תיקים עשויים + מבחר RNA מצמידים ספקטרומטר מסה (MS)11,12,13,14,15. למרות ניסויים אלה להוסיף חלבונים רבים רשימת בשם RBPs, על ידי עיצוב שהם יוכלו להבחין רק חלבונים מאוגדים תעתיקים polyadenylated. עם זאת, רוב RNAs קטן lncRNAs רבים אינם polyadenylated. 16 , 17 , חלבונים שמעצבת שלהם סביר הוחמצו בניסויים אלה. מחקר שנערך לאחרונה חלה בלמידה על חלבון interactome מסדי נתונים כדי לזהות חלבונים מטוהרים במשותף עם מספר RBPs ידוע והראה כי השותפים RBP חוזרים ונשנים האלה היו בסבירות גבוהה יותר להחזיק RNA מחייב פעילות18. עם זאת, גישה זו מסתמכת על כרייה מסדי נתונים קיימים של האינטראקציה גדולה, רק לזהות חלבונים אשר יכול להיות שותף מטוהרים בתנאים שאינם denaturing עם RBPs הידוע, ובכך למעט מניתוח לא מסיסים ממברנה-מוטבע, נדיר חלבונים.
הזיהוי של חלבון כמו bona פיד ה RBP לעתים קרובות אינה נותנת באופן אוטומטי מידע על תפקיד ביולוגי ו/או ביוכימי של אינטראקציה חלבון-RNA. כדי להתייחס לנקודה זו, רצוי בדרך כלל לזיהוי חלבון תחום ושל חומצות אמינו משקעי מעורב האינטראקציה כך מוטציות ספציפיות יכול להיות שנועד לבחון את הפונקציה של איגוד ה-RNA בהקשר של כל הרומן RBP19, 20. הקודם המאמצים על ידי הקבוצה שלנו ואחרים השתמשו שברי חלבון רקומביננטי, מוטציות המחיקה כדי לזהות רנ א איגוד אזורים (RBRs)19,20,21,22; עם זאת, גישות כאלה הם עתירי עבודה תואם לניתוחים תפוקה גבוהה. לאחרונה, מחקר תיאר אסטרטגיית ניסיוני למפות RNA מחייב פעילויות אופנה תפוקה גבוהה באמצעות ספקטרומטר מסה23; עם זאת, גישה זו התבססה על מבחר תיקים עשויים זוגי + RNA, וכך נשא עליו אותן מגבלות כמו זיהוי RBP הגישות שתוארו לעיל.
פיתחנו שיטה, הנקרא RNA איגוד אזור זיהוי (RBR-), המנצלת חלבון-RNA photocrosslinking, ספקטרומטר מסה כמותיים כדי לזהות חלבונים ואזורים חלבון אינטראקציה עם ה-RNA בתאים חיים בלי הנחה על מצב פוליאדנילציה RNA, כולל RBPs מאוגדים תיקים עשויים-RNAs24. יתר על כן, שיטה זו מסתמך אך ורק על crosslinking, יש אין דרישות על מסיסות חלבון או נגישות, ולכן הוא מתאים למיפוי RNA מחייב פעילות בתוך ממברנות (למשל מעטפת הגרעין) או תאים מסיסות ( למשל המטריקס גרעינית). אנו מתארים את השלבים ניסיוני כדי לבצע RBR-מזהה הגרעינים של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs) אבל עם שינויים מזעריים פרוטוקול זה צריך להיות מתאים למגוון רחב של סוגי תאים, ובלבד שהם ניתן לשלב ביעילות 4SU מתרבות בינוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול נסיוני מפורט לביצוע RBR-ID mESCs ו, עם והתאמות, בתוך כל תא שאינו ניתן לשלב 4SU RNA. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה של הגישה כדי להבטיח קליטה מספיק רעש יחס. בנוסף, בעוד הפרוטוקול המתוארים בזאת מתמקדת על הבחינה של גרעיני RBPs, הטכנולוגיה RBR-ID צריך להיות מותאם בקלות תאים הסלו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. נתמכה על ידי התוכנית מלומדים סירל קרן סמית וו (C1404), הצעדה של מטבעות קרן (1-שנות כספים-15-344). שקית מאשר תמיכה של NIH מעניקה R01GM110174 ו- NIH R01AI118891, כמו גם משרד ההגנה הענק BC123187P1. סיפורם-טי נתמך על ידי מענק הכשרה-NIH T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3′ ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5′ splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
