Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN
Summary
Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.
Abstract
RNAs noncoding desempeñan papeles importantes en varios procesos nucleares, incluyendo la regulación de la expresión génica, estructura de la cromatina y la reparación del ADN. En la mayoría de los casos, la acción de noncoding RNAs está mediada por proteínas cuyas funciones están reguladas a su vez por estas interacciones con RNAs noncoding. De acuerdo con esto, un número creciente de proteínas involucradas en funciones nucleares se ha divulgado para enlazar RNA y en algunos casos las regiones de unión de ARN de estas proteínas se ha asignado, a menudo a través de métodos laboriosos, basado en el candidato.
Aquí, Divulgamos un protocolo detallado para realizar una alto rendimiento, todo el proteoma identificación imparcial de sus regiones de unión de ARN y proteínas RNA-que atan. La metodología se basa en la incorporación de un análogo en el ARN celular, seguido por reticulación UV-mediado proteína-RNA y los análisis de espectrometría de masas para revelar RNA-reticulado péptidos en el proteoma de uridina fotoreactivos. Aunque Describimos el procedimiento de células madre embrionarias de ratón, el protocolo debe adaptarse fácilmente a una variedad de células cultivadas.
Introduction
El propósito del método RBR-ID es identificar nuevas proteínas de unión a RNA (restrictivas) y mapa de sus regiones de unión a RNA (RBRs) con resolución de péptido-niveles para facilitar el diseño de los mutantes de unión de ARN y la investigación de los biológicos y bioquímicos funciones de las interacciones proteína-RNA.
ARN es único entre biomoléculas como puede actuar como un mensajero lleva la información genética y también doblar en estructuras tridimensionales complejas con funciones bioquímicas más similares a los de las proteínas1,2. Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que RNAs noncoding (ncRNAs) desempeñan papeles importantes en varios genes vías reguladoras y epigenéticos3,4,5 y, por lo general, estas funciones reguladoras son mediadas en concierto con proteínas que interaccionan específicamente con un determinado RNA. De particular relevancia un conjunto de proteínas de interacción fue identificado recientemente para el ncRNA largo intensamente estudiado (lncRNA) Xist, proporcionando información valiosa sobre cómo este lncRNA interviene en la inactivación del cromosoma x en las células femeninas6,7 ,8. En particular, varias de estas proteínas interactúan Xist no contienen ningún canónica de dominios RNA-que ata9, y por lo tanto su actividad de unión de ARN no podía ser predicha en silico basado en su secuencia primaria solamente. Teniendo en cuenta que miles de lncRNAs se expresan en cualquier célula dada10, es razonable asumir que muchos de ellos pueden actuar vía interacciones con todo ser descubierto proteínas RNA-que atan (restrictivas). Una estrategia experimental para identificar estas nuevas prácticas comerciales restrictivas, por tanto, facilitaría enormemente la tarea de la función biológica de ncRNAs de disección.
Los intentos anteriores para identificar empíricamente restrictivas han dependido de polyA + RNA selección acoplada a espectrometría de masas (MS)11,12,13,14,15. Aunque estos experimentos muchas proteínas ha añadido a la lista de supuestas prácticas comerciales restrictivas, por diseño podría sólo detectan las proteínas a las transcripciones de la cofia. Sin embargo, más pequeño RNAs y muchos lncRNAs no son contra. 16 , 17 y sus proteínas interactuantes probablemente habría sido perdidas en estos experimentos. Un estudio reciente aplicado aprendizaje automático a las bases de datos del interactoma de proteínas para identificar proteínas que co purificaron con múltiples prácticas comerciales restrictivas conocidas y demostró que estos socios recurrentes de la RBP tenían más probabilidades de poseer actividades de unión de ARN18. Sin embargo, este enfoque se basa en la minería de bases de datos existentes de gran interacción y sólo puede identificar proteínas que pueden ser co purificadas en condiciones no desnaturalizantes con prácticas comerciales restrictivas conocidas, excluyendo así a partir del análisis insoluble, embebido en la membrana y escaseado proteínas.
La identificación de una proteína como un bona fide las prácticas comerciales restrictivas a menudo no producen automáticamente información sobre la función biológica o bioquímica de la interacción proteína-RNA. Para abordar este punto, es típicamente conveniente para identificar las proteína dominio y aminoácido residuos implicados en la interacción que mutantes específicos pueden ser diseñados para probar la función de enlace de RNA en el contexto de cada novela RBP19, 20. los esfuerzos anteriores de nuestro grupo y otros han utilizado fragmentos de la proteína recombinante y mutantes de la canceladura identificar RNA binding regiones (RBRs)19,20,21,22; sin embargo, estos enfoques son intensivas e incompatible con el análisis de alto rendimiento. Más recientemente, un estudio describe una estrategia experimental para actividades de unión de ARN en forma de alto rendimiento usando spectrometry total23; sin embargo, este enfoque se basó en una selección doble polyA + RNA y llevó así a las mismas limitaciones que los enfoques de identificación de las prácticas comerciales restrictivas descritas anteriormente.
Hemos desarrollado una técnica, denominada RNA enlace región identificación RBR-, que explota a proteína-RNA photocrosslinking y cuantitativo espectrometría de masas para identificar las proteínas y las regiones de la proteína interacción con RNA en células vivas sin hacer hipótesis sobre el estado de poliadenilación del RNA, así como prácticas comerciales restrictivas obligado a polyA-RNAs24. Además, este método se basa exclusivamente en la reticulación tiene ninguÌ n requisito en la solubilidad de la proteína o accesibilidad y es así conveniente para las actividades de unión de ARN dentro de las membranas (por ejemplo, la envoltura nuclear) o compartimentos poco solubles ( por ejemplo, la matriz nuclear). Describimos los pasos experimentales para realizar identificación de RBR para los núcleos de células madre embrionarias de ratón (troncales) pero con pequeñas modificaciones este protocolo debe ser conveniente para una variedad de tipos celulares, que pueden incorporar eficientemente 4SU de la cultura medio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un protocolo experimental detallado para realizar la identificación de RBR en troncales y, con modificaciones apropiadas, en cualquier célula que puede incorporar 4SU RNA. Otros tipos de células pueden requerir optimización del enfoque para asegurar una suficiente relación señal a ruido. Además, mientras que el protocolo descrito aquí se centra en el examen de prácticas comerciales restrictivas nucleares, la tecnología de RBR-ID debe ser fácilmente adaptable a diferentes compartimentos celulares, c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. fue apoyado por el programa de eruditos de Searle, la Fundación de Smith W.W. (C1404) y la March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconoce apoyo de NIH concede R01GM110174 y R01AI118891 de NIH, así como DOD conceder BC123187P1. R.W.-T. fue apoyado por la beca de formación de NIH T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
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