Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.
Abstract
Forensisches RNAs spielen eine wichtige Rolle in mehreren nukleare Prozesse, einschließlich der Regulierung der Genexpression, Chromatinstruktur und DNA-Reparatur. In den meisten Fällen ist die Wirkung von nichtcodierender RNA durch Proteine vermittelt, deren Funktionen durch diese Interaktionen mit nichtcodierender RNA wiederum reguliert werden. Einklang mit diesem, eine wachsende Zahl von Proteinen, die in atomaren Funktionen berichtet wurde RNA binden und in einigen Fällen die RNA-bindende Regionen dieser Proteine haben kartiert, oft durch mühsame, Kandidaten-basierte Methoden.
Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll, eine Hochdurchsatz-, Proteom-weite unvoreingenommene Identifizierung der RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen durchzuführen. Die Methode stützt sich auf die Aufnahme von einem photoreaktiven Uridin analog in die zelluläre RNA, gefolgt von UV-vermittelten Protein-RNA-Vernetzung und Massenspektrometrie analysiert RNA-vernetzt-Peptide in das Proteom zu offenbaren. Obwohl wir die embryonalen Stammzellen der Maus beschrieben, sollte das Protokoll eine Vielzahl von kultivierten Zellen leicht angepasst.
Introduction
Der RBR-ID-Methode soll neuen RNA-bindende Proteine (RBPs) zu identifizieren und ordnen Sie ihre RNA-bindende Regionen (RBRs) mit Peptid-Ebene Auflösung ermöglichen die Gestaltung von RNA-bindende Mutanten und die Untersuchung der biologischen und biochemischen Funktionen von Protein-RNA-Interaktionen.
RNA ist einzigartig unter den Biomolekülen, denn es kann sowohl fungieren als ein Bote die genetischen Informationen und auch in komplexe dreidimensionale Strukturen mit biochemischen Funktionen eher derjenigen Proteine1,2Falten. Eine wachsende Zahl von Beweisen zufolge forensisches RNAs (NcRNAs) spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen gen Regulierungs- und epigenetische Wege3,4,5 , und in der Regel werden diese regulatorischen Funktionen im Konzert vermittelt mit Proteinen, die speziell mit einem bestimmten RNA interagieren. Von besonderer Bedeutung wurde eine Reihe von interagierenden Proteine für die intensiv studierte lange NcRNA (LncRNA) Xist, wertvolle Einblicke in wie diese LncRNA X-Chromosom Inaktivierung in weiblichen Zellen6,7 vermittelt kürzlich identifiziert. ,8. Bemerkenswert ist, könnte mehrere dieser Xist-Interaktion Proteine enthalten keine kanonischen RNA-bindende Domänen9, und daher ihre RNA-bindende Aktivität nicht vorhergesagt in Silico basierend auf ihre primäre Sequenz allein. Wenn man bedenkt, dass Tausende von LncRNAs in einer bestimmten Zelle10ausgedrückt werden, ist es vernünftig anzunehmen, dass viele von ihnen über Interaktionen mit handeln könnte, doch sein RNA-bindende Proteine (RBPs) entdeckt. Eine experimentelle Strategie, um diese neuartige RBPs identifizieren würde daher die Aufgabe die biologische Funktion von NcRNAs sezieren erheblich erleichtern.
Frühere Versuche, RBPs empirisch ermitteln Vertrauen auf PolyA + RNA Auswahl gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS)11,12,13,14,15. Obwohl diese Experimente viele Proteine in die Liste der vermeintlichen RBPs hinzugefügt, könnte sie standardmäßig nur Proteine gebunden, Polyadenylated Abschriften erkennen. Die meisten kleinen RNAs und viele LncRNAs sind jedoch nicht Polyadenylated. 16 , 17 und ihre interagierenden Proteine hätte wahrscheinlich in diesen Experimenten verpasst worden. Eine aktuelle Studie angewendet Computerlernen Proteinprotein Interaktom-Datenbanken, um Proteine zu identifizieren, die gemeinsam mit mehreren bekannten RBPs gereinigt und zeigte, dass diese wiederkehrende RBP-Partner eher RNA-bindende Aktivitäten18zu besitzen. Doch dieser Ansatz stützt sich auf Bergbau große Interaktion Datenbanken und erkennen nur Proteine, die Co gereinigten nicht denaturierenden Bedingungen mit bekannten RBPs, also ohne aus der Analyse unlöslich, Membran eingebettet und knapp sein kann Proteine.
Die Identifizierung eines Proteins als Bona Fide RBP oft nicht automatisch Informationen zur biologischen und/oder biochemische Funktion der Protein-RNA-Interaktion Ausbeute. Um diesen Punkt zu begegnen, ist es in der Regel wünschenswert, die Domäne und Aminosäure Proteinreste an der Interaktion Beteiligten zu identifizieren, so dass bestimmte Mutanten gestaltet werden können, testen Sie die Funktion des RNA-bindende im Zusammenhang mit jeder Roman RBP19, 20. frühere Bemühungen von unserer Fraktion und anderen haben zum rekombinantes Proteinfragmente und Löschung Mutanten RNA bindenden Regionen (RBRs)19,20,21,22; identifizieren solche Ansätze sind jedoch arbeitsintensiv und unvereinbar mit Hochdurchsatz-Analysen. Vor kurzem beschrieben eine Studie eine experimentelle Strategie zur RNA-bindende Aktivitäten in einer Hochdurchsatz-Mode mit Massenspektrometrie23Karte; jedoch dieser Ansatz stützte sich auf eine doppelte PolyA + RNA-Auswahl, und so trug die gleichen Einschränkungen wie die RBP Identifikation Ansätze beschrieben.
Wir entwickelten eine Technik, genannt RNA bindenden Region Identifikation (RBR-ID), die Protein-RNA-Photocrosslinking und quantitative Massenspektrometrie, Proteine und Eiweiß Regionen mit RNA in lebenden Zellen ohne Interaktion identifizieren nutzt Annahme auf der RNA Polyadenylation Status, also auch RBPs verpflichtet PolyA-RNAs24. Darüber hinaus diese Methode stützt sich ausschließlich auf Vernetzung und hat keine Anforderungen an Protein Löslichkeit oder Zugänglichkeit und eignet sich somit zur RNA-bindende Aktivitäten innerhalb von Membranen (z.B. die Kernhülle) oder schwerlösliche Fächer (Karte z.B. die Kernmatrix). Wir beschreiben die experimentellen Schritte ausführen RBR-ID für die Kerne der embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) sollte mit geringfügigen Änderungen dieses Protokolls jedoch geeignet für eine Vielzahl von Zelltypen, vorausgesetzt, dass sie effizient 4SU aus der Kultur integrieren können Medium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben ein detaillierte experimentelle Protokoll ausführen RBR-ID in mESCs und mit entsprechenden Modifikationen in eine beliebige Zelle, die 4SU in RNA integrieren können. Andere Zelltypen erfordern Optimierung des Konzepts für ein ausreichendes Signal Rauschabstand zu gewährleisten. Darüber hinaus während des Protokolls hierin konzentriert sich auf die Prüfung der nuklearen RBPs beschrieben, sollte die RBR-ID-Technologie leicht verschiedenen zellulären Kompartimenten wie dem Zytosol oder spezifische Or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.b. wurde von Searle Scholars Program, w. Smith Foundation (C1404) und der Marsch des Dimes Foundation (1-FY-15-344) unterstützt. Bag nimmt zur Kenntnis, Unterstützung von NIH R01GM110174 und NIH R01AI118891, Zuschüsse sowie DOD BC123187P1 zu gewähren. R.W.-T. von NIH Ausbildung Grant T32GM008216 unterstützt wurde.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
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