Fields Tedavisi Tümör kullanma Kanserli Hücreleri için optimum inhibitör Frekans (TTFields) Belirlenmesi

In Vitro Uygulama Sistemi 1. TTFields – Taban Plakası ve Bulaşık Bakım musluk suyu altında yemekleri ve bulaşık kapaklarını durulayın. Daha sonra, iyonu giderilmiş su ve hava kuru yüzü aşağı ile yıkayın. bir kemoterapötik ajan / madde, önceki deneyde tabaklara eklenmiş ise,% 5 açık bir deterjan çözeltisi ile her bir çanak dolgu ve bir gece bekletin. İyice çanak içindeki deterjan izlerini önlemek için akan musluk suyu altında bulaşıkları yıkayın. bulaşıkları yıkayın ve bulaşık aşağı deiyonize su ve hava kuru yüzüyle kapsar. sterilizasyon torbaları içine kendi kapakları ile temiz ve kuru yemekleri yerleştirin. Yemekler yüz aşağı ile kapatın ve bir otoklavda çanta yerleştirin. 121 ° C'den daha yüksek bir sıcaklıkta, 30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. kısmen otoklav kapağını açın, bir kurutma programı ile otoklav ayarlayın ve 30 dakika boyunca yemekler kurutun. Hafif% 70 etanol ile ıslatılmış bir bezle taban plakası silin. </ Ol> 2. Deney Kurulumu NOT: Bu protokolde kullanılan tüm ekipman ve malzemeler Malzeme Listesinde açıklanmıştır. Steril koşullar muhafaza ederken tüm adımlar aşağıda bir laminar akış kabini içinde yapılmalıdır. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi, temiz ve steril TTFields yemekleri ve kapakları hazırlayın hafifçe% 70 etanol ile ıslatılmış bir bez ile taban plakası silin. tabağına hafifçe bastırarak ve taban plakası üzerinde üç pimin üzerine bulaşık kilitleri ağız kadar yaklaşık 5 mm saat yönünde çevirerek taban plakası üzerine kapaklı TTFields yemekler takın. Her bir tabağın tabanına steril bir 22 mm lamel (işlenmiş plastik veya cam) yerleştirin. tam büyüme ortamında hücre süspansiyonu (U-87 MG ve F98 için Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı hazırlamak; RPMI A2780 ve OVCAR-3, tarif edildiği gibi ilave Malzemeler Listesi). NOT: ceII konsantrasyonu% 80-% 90 birleşen hücre büyümesi, deneyin sonuna kadar aşılmamalıdır, hücre tipleri ve deney süresine bağlıdır. DİKKAT: İnsan hücre hatları biyolojik bir tehlike temsil edebilir ve uygun güvenlik önlemleri ele alınmalıdır. Her lamel merkezi bir damla olarak hücre süspansiyonu (iki katına çıkma süresi ile ilgili olarak, bir 72-st bir deney için 200 uL genellikle 5,000-20,000 hücre), 200 uL yerleştirin ve bulaşık kapaklı kapsamaktadır. Hücreler uygun kadar bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe edilir; Bir gece boyunca inkübasyon bu aşamada mümkündür. Bir 200- veya 1000-mcL pipet kullanarak menüden sıvıları aspire. Yavaşça her yemeğin doldurmak için, tam büyüme ortamında 2 mL pipetle. pipet steril ucu kullanın ve usulca bazen slayt altında yakalandı hava kabarcıklarını çıkarmak için lamel kenarları hafifçe vurun. Onların kapaklı yemekleri örtün ve onlara ins yerleştirmekTTFields Tedavinin başlangıcında kadar 37 ° C'de bir CO2 inkübatör ide. 3. TTFields Başvurusu Bir soğutma CO2 inkübatöründe bağlı TTFields yemekler ile taban plakaları aktarın. Not: nitro TTFields uygulama ısı üretecek olarak; Dolayısıyla, bir buzdolabında inkübatör yemeklerin ısınma telafi etmek gereklidir. Daha yüksek TTFields yoğunluklar daha fazla ısı üretecek ve daha düşük inkübatör ortam sıcaklıkları (Tablo 1 e bakınız) gerektirecektir. TTFields uygulama için kuluçka sıcaklığı 18-30 ° C aralığında olduğu zaman klinik olarak önemli TTFields yoğunlukları elde edilir. taban plakasına düz kablo, dişi konektör bağlayın. üzerinde TTFields jeneratör açın. In vitro uygulama sistemi yazılımında TTFields başlatın ve deney ayarlarını seçin. Yeni bir deneme tanımlayın. exp adını yazıneriment ve bilgisayar ekranında yazılım kullanıcı arayüzünde deney sahibi. Her bir tabak ya da taban plakası için olan frekans ve hedef sıcaklığa ayarlayın. yazılımını kullanarak TTFields uygulamasını başlatın. Tüm yemekler düzgün bağlandığından emin olun ve monitörde açık mavi görüntülenir. Bir tabak kırmızı çerçeve ile çember ise (düzgün bağlı olmadığı anlamına gelir), hafifçe bastırın ve kontakları tamir edilinceye kadar ileri geri yavaşça döndürün ve çanak açık mavi görünür. En fazla 24 saat çalışan vitro uygulama sisteminde TTFields bırakın. Deney son noktaya ulaşırsa, yazılımda SON DENEY düğmesine tıklayarak denemeyi durdurup, 5. Değilse adım PAUSE deney tıklayın geçin. taban plakasından düz kablo konnektörü ayırın. Laminer akış kabinine inkübatör yemekleri ile taban plakasını sökün. Tüm çanak orta değiştirinHer 24 saatte bir yıkayın ve taban plakasını buzdolabında bulunan inkübatöre geri gönderin. Yassı kabloyu kullanarak taban plakasını jeneratöre bağlayın. CONTINUE düğmesine tıklayarak denemeye devam edin. 4. Kontrol Örnekleri Not: TTFields uygulaması hariç, kontrol hücrelerini TTFields ile işlem gören hücrelere benzer koşullarda büyütün. Aynı süspansiyonlu ve TTFields ile muamele edilmiş numunelerin kaplanması için kullanılan benzer bir yüzey üzerindeki plaka kontrol numuneleri. Kontrol kaplarını 37 ° C'de CO 2 inkübatörüne yerleştirin. Ortamı, her 24 saatte bir TTFields ile işlenmiş çanak ortam koşullarıyla eşleştirmek için bulaşıkları değiştirin. 5. Deney Bitir DENEME SONU'ya tıkladıktan sonra, yazılımın sistemdeki tüm kayıtları almasını ve kayıtları bilgisayara kaydetmesini bekleyin. Sıcaklık, akım ve direnç günlüğünü görmek için RAPORLAR düğmesini kullanın fher bir taban plakasının Iles yemekler deney planına göre tedavi edildi doğrulamak için. NOT: Tüm raporlar ve günlükleri deney bittikten sonra bilgisayara kaydedilir ve herhangi bir zamanda gözden geçirilebilir. TTFields jeneratör kapatın. taban plakasından düz kablosunu ve inkübatör çıkarın. aşağı bir seramik tabak çıkarmak için, Altlığından kilidini saat yönünün yemeğin açmak için. Laminer akış kabinine bulaşıkları alın ve aseptik lamelleri çıkarın. Daha fazla kontrol ve değerlendirme için taze ortam ya da fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren Petri kapları steril aktarın. TTFields Etkisinin Değerlendirilmesi 6. NOT: TTFields' etkileri çeşitli şekillerde belirlenebilir. muamele edilmemiş kontrol hücrelerine muamele edilmiştir karşılaştırmak için aşağıdaki yöntemlerden bir veya daha fazlası kullanılır: Hücre sayımı Her bir lamel içeren çanak orta / PBS çıkarın. Bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de (hücre lamel yüzeyinden ayırmak başlayana dek, yani) her bir tabağa, 0.5 mL% 0.25 tripsin / EDTA ilave ve 10 dakika inkübe edilir. tripsin nötralize yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme hücrelerin yeniden askıya almak için, tam büyüme ortamında 0.5 mL ekleyin. Düşük hücre konsantrasyonları sayma ile uyumlu olan herhangi bir standart hücre sayımı tekniği kullanarak hücreleri sayın (yani, yaklaşık 20,000 hücre / mL) eklenmiştir. kolojenık incelemesi yeni, steril Petri kutularına ya da taze tam büyüme ortamında 2 mL içeren 6 oyuklu plakalar üzerine Her bir tabaktan alınan hücre benzer sayıda (tabak başına 100-500 hücre) Plate. ~ 50 hücre oluşur müteşekkil kolonilerinin (her bir hücre hattı özelliklerine bağlı olarak) 1-3 hafta boyunca 37 ° C'de bir CO2 inkübatör içinde inkübe edin. hücreyi değerlendirinIşık mikroskobu ile koloni başına sayısı. Ortamı çıkarın ve PBS ile yıkayın. PBS çıkarın ve buz soğukluğunda metanol (1 mL) ilave edilir. 10 dakika veya daha uzun bir süre -20 ° C'de inkübe edin. metanol çıkarın. Kristal viyole çözeltisi (% 0.1 a / su içinde% 25 h / h metanol içerisinde v) ilave edilir ve 20 dakika inkübe edilir. DİKKAT: Kristal viyole potansiyel bir kanserojen olduğu; kristal mor ile çalışırken eldiven kullanın. , Kristal viyole kaldırma deiyonize su ile 3 kez yıkanır ve hava ile kurutulur. Her bir tabağın içinde oluşturulmuş kolonileri sayın.