Определение оптимальной частоты ингибирования для злокачественных клеток с использованием полей для лечения опухолей (TTFields)
Summary
Поля для лечения опухолей (TTFields) – эффективный метод противоопухолевой терапии, обеспечиваемый непрерывным неинвазивным применением низкоинтенсивных, промежуточных и чередующихся электрических полей. Применение TTFields к клеточным линиям с использованием системы прикладных программ TTFields in vitro позволяет определять оптимальную частоту, которая приводит к наивысшему снижению количества клеток.
Abstract
Опухоль Лечение Fields (TTFields) являются эффективным методом лечения доставляется через непрерывного, неинвазивного применения низкой интенсивности (1-3 В / см), переменных электрических полей в диапазоне частот от нескольких сотен кГц. Исследование TTFields в культуре ткани осуществляется с использованием TTFields в пробирке прикладной системы, что позволяет применение электрических полей различной частоты и интенсивность в керамические чашки Петри с высокой диэлектрической проницаемостью (ɛ> 5000). Раковые клеточные линии высевают на покровных в нижней части керамической чашки Петри подвергают TTFields доставленного в двух ортогональных направлениях на различных частотах, чтобы облегчить лечение испытаний результата, такие как числа клеток и клоногенные анализы. Результаты, представленные в настоящем докладе, показывают, что оптимальная частота TTFields по обоим пунктам клеток и клоногенные анализов составляет 200 кГц для обоих яичников и клеток глиомы.
Introduction
Опухолевые Лечащие Поля (TTFields) являются анти-митотической модальностью для лечения глиобластомы и потенциально других типов рака. Поля доставляются с помощью непрерывного применения низкой интенсивности (1-3 В / см), промежуточной частоты (100-500 кГц), переменных электрических полей в области опухоли 1, 2. Применение TTFields в пробирке и в естественных условиях было показано, ингибирует как рост различных раковых клеточных линий и прогрессирование опухолей в нескольких опухолевых животных моделей 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Экспериментальные клинические испытания и более крупных рандомизированных исследований у больных с солидными опухолями, в том числе глиобластомы и немелкоклеточного рака легкого, у demonstоценили безопасность и эффективность непрерывного применения TTFields 8, 9, 10. Была найдена Эффективность TTFields быть: (1) зависит от частоты, с определенными оптимальными частотами ведущих к самому высокому сокращению количества клеток клеточных линий из различных источников 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) Интенсивность в зависимости от электрического поля, с минимальным порогом активности со скоростью около 1 В / см и более мощных высоких интенсивности 1, 2, 7, 11; (3) усиливается , когда длительность лечения больше 5; и (4) выше, когда 2 направления TTFields были применены перпендикулярно друг друЭр, по сравнению с электрическими полями, приложенными с одного направления 1 . Основываясь на вышеприведенных данных, TTFields можно применять для пациентов на длительный период времени, используя 2 набора массивов преобразователей, локализованных на коже пациентов, чтобы максимизировать интенсивность электрического поля в слое опухоли 12 , 13 .
Изучение эффектов TTFields на раковые клетки in vitro в настоящее время дает единственный способ определить оптимальную частоту, применяемую к конкретному типу опухоли. Тестирование на оптимальную частоту требует устройства, которое позволяет применять различные частоты в диапазоне 100-500 кГц и при интенсивностях среднеквадратичного значения (до среднеквадратичного значения 3 В / см) для культуры клеток. Поскольку приложение TTFields вырабатывает тепло, прикладная система требует способности рассеивать избыточное тепло, сохраняя при этом жесткий контроль над температурой.
Несколько устройстве годы развиваются , чтобы разрешить применение TTFields в клеточных культурах 1, 2, 5, 14, 15, 16. Во всех этих устройствах, электроды , используемые были изолированы, чтобы избежать предостережений , связанные с использованием проводящих электродов, такими , как обмен электронов на поверхности электрода и высвобождение ионов токсичных металлов в среду 1. Основное различие между различными прикладными системами TTFields тестируемых является тип электрода изоляции используется, либо с электродами из металлической проволоки с изоляцией тонкой пленкой диэлектрика 2, 14, 15, 16 или с высокой диэлектрической проницаемости материала (например, свинец магния ниобата свинца-titanatе (ПМН-СТ)) 6. В то время как с изолированным проволочные электроды предлагают относительно простую и экономически эффективное решение для применения TTFields, они часто ограничены высокого напряжения, необходимого для достижения эффективной напряженности электрического поля выше порогового значения 1 В / см и поверхностью, доступной для клеточной обшивки, как расстояние между электродами является относительно небольшим. Системы на основе электродов изолированы с помощью высокой диэлектрической проницаемости материала требуются специальные конструкции и производственные возможности, но они не требуют высокого напряжения и может предложить большую площадь для роста клеток между электродами.
В пробирке прикладной системы TTFields используется в этой работе принадлежит к последнему классу систем, причем основной блок будучи чашки Петри (TTFields блюдо, рисунок 1) состоит из высокой диэлектрической проницаемости керамики (т.е., ПМН-СТ). Две паров электродов напечатаны перпендикулярны на внешних валяхLs на блюдо TTFields, чтобы обеспечить применение электрических полей от 2-й направлений. Электроды подключены к синусоидальной формы сигнала генератора и усилителя, который позволяет для применения TTFields в частотном диапазоне 50-500 кГц. Для того, чтобы рассеивать избыточное тепло, блюда TTFields находятся внутри охлажденный инкубатор, со средой контроля температуры осуществляется с использованием постоянного контроля температуры тарелки и корректировкой напряжения, приложенным к системе. На практике установка инкубатора до более низкой температуры приведет к увеличению напряженности электрического поля, так как система увеличивает напряжение до целевой температура в чашке не будет достигнута. Разница между температурой внутри тарелки и температурой инкубатора может привести к некоторому испарению, в зависимости от температурных градиентов; следовательно, культуральная среда должна быть заменена каждые 24 ч, чтобы поддерживать адекватные условия роста.
Протокол нижеописывает экспериментальную процедуру для оптимизации применения TTFields частот к раковым клеткам таким образом, что максимальное уменьшение ячейки подсчета и уменьшение потенциала выживших клеток с образованием колоний достигаются.
Protocol
Representative Results
Discussion
TTFields – это новая противоопухолевая модальность, основанная на непрерывном применении правильно настроенных переменных электрических полей 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 . Максимизация противоопухолевой эффективности является желательным результатом для всех методов лечения. Таким образом, «борьба» за каждый дополнительный процент ингибирования роста злокачественных клеток может оказать значительное влияние на долгосрочный клинический исход для пациентов. Это связано с требуемым непрерывным характером применения TTFields и связанным с этим кумулятивным эффектом. Максимизация применения TTFields может быть достигнута несколькими способами: (1) повышение интенсивности электрического поля 1 , 7 , (2) удлинение продолжительности лечения 5 , (3) поиск наиболее эффективных комбинацийна с другими методами лечения 18, 19, и (4) определение оптимальной частоты 1, 2, 4, 6, 7. Максимизация напряженность электрического поля в месте опухоли достигается за счет оптимизации расположения массивов на коже пациента; это позволяет для доставки максимальной интенсивности поля к опухоли , основанных на индивидуальной анатомии пациента 20. Удлинение продолжительность лечения зависит главным образом от соблюдения пациента с лечением ( в течение по крайней мере 18 часов в день) 17. Нахождение правильного сочетания с другими методами лечения и определение оптимальной частоты в значительной степени зависит от результатов в пробирке, а не подтвержденные маркеров для результатов лечения TTFields На данный момент доступны. В этой работе мы выделили экспериментальный рНеобходимые для определения оптимальной частоты TTFields для раковых клеточных линий с использованием системы применения TTFields in vitro . Описанные здесь методы потенциально могут быть использованы для скрининга комбинации других методов лечения рака ( например, химиотерапевтических агентов или облучения) с TTFields и для определения оптимальной частоты введения TTField для каждой конкретной комбинированной терапии.
В соответствии с предыдущими публикациями, результаты, показанные здесь, демонстрируют, что оптимальная частота для лечения как клеток глиомы, так и раковых клеток яичников составляет 200 кГц 1 , 7 . В этой работе мы впервые продемонстрировали, что оптимальная частота TTFields для снижения клоногенного потенциала связана с частотой, которая приводит к максимальному цитотоксическому эффекту. Методы , использованные в этой работе для количественной оценки эффектов TTFields ( т.е. цитотоксических и клоногенных) aповторно только два из множества возможных стандартных конечных анализов для оценки результатов лечения. Дополнительные тесты результатов лечения включают в себя: (1) фиксация, окрашивание, и монтаж покровные, на которой клетки высевают над микроскопом для визуализации внутриклеточных структур; (2) проведение анализов белка и РНК экстрактов, либо из самих блюд TTFields или после передачи покровного к новой одноразовой тарелке; и (3) trypsinizing клетки окрашивали для проточной цитометрии.
Тщательное экспериментальное планирование повлияет на результаты лечения после доставки TTFields. Основные шаги включают в себя обеспечение того, чтобы пролиферация клеток на протяжении всего эксперимента не приводит к разрастанию и с помощью соответствующей напряженности электрического поля, а интенсивность, которые являются слишком высокими, когда применяются к конфиденциальным клеточным линиям приведет к слишком несколько ячеек для необходимых анализов для определения оптимальная частота. И наоборот, TTFields применяется при очень низких интенсивностяхна менее чувствительных клеточных линий будет приводить к небольшому эффектов, которые могут быть замаскированы с помощью присущей вариации. Бревна лечения должны быть проверены на предмет ценной информации относительно стабильности температуры, электрического тока и сопротивления для каждого блюда в течение всего эксперимента. Замена неисправного блюда в начале лечения и исключить данные из блюда, которое не отвечало желаемые параметрам лечения позволит свести к минимуму изменчивости между повторами.
Таким образом, TTFields являются появляющаяся лечение противоопухолевой модальность , которая уже показала свою эффективность и безопасность в клинических условиях 8, 9, 10. Тестирование TTFields в качестве параметра в пробирке с использованием протоколов , описанных здесь , может позволить для оптимизации параметров TTFields лечения в клинических условиях и может расширить наше понимание основного механизма действия.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют никаких подтверждений.
Materials
| inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
| Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
| Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
| Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
| Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
| Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
| Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
| Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
| PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
| A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
| F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
| U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
| Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |
References
- Kirson, E. D., et al. Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).
- Kirson, E. D., et al. Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields. Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).
- Gera, N., et al. Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Giladi, M., et al. Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields. Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).
- Giladi, M., et al. Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells. Sci Rep. 5, 18046 (2015).
- Giladi, M., et al. Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo. Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).
- Voloshin, T., et al. Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo. Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).
- Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &, D. A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).
- Stupp, R., et al. Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).
- Stupp, R., et al. NovoTTF-100A versus physician’s choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality. Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).
- Kanner, A. A., et al. Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician’s choice chemotherapy. Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).
- Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &, J. P. Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma. Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).
- Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas. Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).
- Kim, E. H., et al. Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation. Oncotarget. , (2016).
- Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &, M. Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis. Oncotarget. , (2016).
- Pavesi, A., et al. Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application. Sci Rep. 6, 26584 (2016).
- Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation. Cancer Med. , (2015).
- Kirson, E. D., et al. Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields). BMC Med Phys. 9, (2009).
- Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &, Y. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters. BMC Cancer. 10, 229 (2010).
- Connelly, J., et al. Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement. BMC Cancer. 16 (1), (2016).
