קביעת תדירות המעכבות האופטימלית עבור תאים סרטניים באמצעות גידול טיפול פילדס (TTFields)

1. TTFields במערכת Application גופית – צלחת הבסיס ותחזוקה Dish שוטפת כלים, מכסה צלחת תחת מים זורמים מהברז. לאחר מכן לשטוף עם מים ללא יונים ולמטה פנים יבש-אוויר. אם סוכן / סמים כימותרפיות נוספו מנות בניסוי קודם, למלא כל מנה בתמיסת ניקוי 5% לאור ולהשאיר למשך לילה. יש לשטוף את הכלים ביסודיות תחת מים זורמים מברז כדי למנוע כל עקבות של חומר ניקוי בתוך הצלחת. יש לשטוף את הכלים ואת צלחת מכסה עם מים ללא יונים ופן אוויר יבש למטה. הכנס את הכלים נקיים ויבשים שכריכותיהם לתוך שקיות עיקור. חותם ולמקם את התיקים ב חיטוי, עם המנות עם הפנים כלפי מטה. חיטוי במשך 30 דקות ב שלא יעלה על 121 מעלות צלזיוס. הגדר את החיטוי על תכנית יבשה, חלקית לפתוח את דלת החיטוי, ולייבש את הכלים עבור 30 דקות. נגב את צלחת הבסיס באמצעות מטלית ספוגה קלה עם אתנול 70%. </ Ol> 2. הגדרת הניסוי הערה: כל החומרים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה מתוארים ברשימת החומרים. כל השלבים הבאים צריך להתבצע בתוך ארון זרימה למינרית בעוד תנאים סטריליים נשמרים. הכן את הכלים והמכסים הטפיליים והנקיים של TTFields, כמתואר בסעיף 1. נגב את צלחת הבסיס עם מטלית לחה קלות באתנול של 70%. התקן את הכלים TTFields עם מכסה על צלחת הבסיס על ידי לחיצה בעדינות על צלחת סיבוב בכיוון השעון על ידי 5 מ"מ עד שפת המנעול נועל על שלושה סיכות על צלחת הבסיס. מניחים סטרילי 22 מ"מ coverslip (מטופלים פלסטיק או זכוכית) על החלק התחתון של כל מנה. הכן את ההשעיה התא במדיום צמיחה מלאה (Dulbecco שונה של הנשר בינוני עבור U-87 MG ו F98, RPMI עבור A2780 ו OVCAR-3, בתוספת כמתואר ב רשימת חומרים). הערה: ה – CELl ריכוזים תלויים סוגי תאים משך הניסוי, 80% -90% התאים confluent התא לא צריך להיות חריגה עד סוף הניסוי. זהירות: קווי תאים אנושיים עשויים לייצג סיכון ביולוגי ויש לטפל בהם באמצעי הבטיחות המתאימים. מקום 200 μL ההשעיה התא (בדרך כלל 5,000-20,000 תאים μL 200 לניסוי 72 שעות, בהתאם לזמן הכפלת) כמו ירידה במרכז coverslip כל לכסות את המכסה צלחת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור עד התאים לדבוק; הדגירה לילה אפשרי בשלב זה. לשאוב את הנוזלים מן הירידה באמצעות פיפטה 200 או 1000-μL. בעדינות פיפטה 2 מ"ל של המדיום צמיחה מלאה למלא כל מנה. השתמש קצה סטרילית פיפטה ו בשקט הקש על הקצוות coverslip לשחרר את בועות אוויר מדי פעם נתפס מתחת לשקופית. מכסים את הכלים עם המכסים שלהם ומכניסים אותם פנימהIDE חממה CO 2 ב 37 ° C עד תחילת הטיפול TTFields. 3. TTFields Application מעביר את צלחות בסיס עם מנות TTFields המצורפות חממת CO 2 בקירור. הערה: In vitro יישום TTFields יפיק חום; ולכן, חממה בקירור נדרשה לפצות על ההתחממות של המנות. עוצמות TTFields גבוהות תפקנה יותר חום תדרושנה בטמפרטורות סביבת חממה נמוכה (ראה טבלה 1). מבחינה קלינית בעוצמות TTFields הרלוונטי מושגות כאשר הטמפרטורה בחממה במשך יישום TTFields היא בטווח של 18-30 מעלות צלזיוס. חבר את מחבר הנקבה הכבל השטוח צלחת הבסיס. החלף מחולל TTFields על. התחל את TTFields בתוכנת מערכת יישום במבחנה ובחר את גדרות הניסוי. גדר ניסוי חדש. הקלד את השם של experiment ובעל הניסוי בממשק המשתמש של התוכנה על מסך המחשב. התאם את התדירות ואת טמפרטורת היעד עבור כל צלחת צלחת או בסיס. הפעל את יישום TTFields באמצעות התוכנה. ודא שכל הכלים מחוברים כראוי מופיע בצבע תכלת על הצג. אם צלחת שמקיפה אותה עם מסגרת אדומה (כלומר הוא אינו מחובר כראוי), ומהדק אותו בעדינות לסובב לאט קדימה ואחורה עד המגעים משוחזרים ואת המנה מופיעה תכלת. השאר את TTFields במערכת יישום במבחנה פועל עד 24 שעות. אם הניסוי מגיע נקודת הסיום שלו, להפסיק את הניסוי על ידי לחיצה על הכפתור סיים את הניסוי בתוכנה ולהמשיך לשלב 5. אם לא, לחצו על השהה ניסוי. ניתק את מחבר הכבל השטוח מצלחת הבסיס. הסר את צלחת הבסיס עם מנות מן החממה לארון זרימה למינרית. החלף את המדיום בכל צלחתEs כל 24 שעות ולהחזיר את צלחת הבסיס כדי חממה בקירור. חבר את לוח הבסיס לגנרטור באמצעות הכבל השטוח. המשך בניסוי על ידי לחיצה על הלחצן CONTINUE. 4. בקרת דוגמאות הערה: לגדל תאים שליטה בתנאים דומים לתאי TTFields שטופלו, למעט יישום TTFields. פלייט בקרת דגימות עם ההשעיה אותו על משטח דומה המשמש ציפוי דגימות TTFields שטופלו. מניחים מנות שליטה CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. החלף את המדיום במנות כל 24 שעות כדי להתאים את התנאים TTFields צלחת בינונית. 5. סיום הניסוי לאחר לחיצה על END EXPERIMENT, המתן לתוכנה לאחזר את כל הרשומות מהמערכת ולשמור את הרשומות במחשב. השתמש בלחצן REPORTS כדי לסקור את הטמפרטורה, זרם ההתנגדות והיומן התנגדותאיילס כל צלחת בסיס כדי לוודא שכל הכלים טופלו בהתאם לתכנית הניסיונית. הערה: כל הדיווחים והיומנים נשמרים במחשב לאחר תום הניסוי ניתן לעיין בכל עת. כבו את הגנרטור TTFields. ניתקתי את הכבל השטוח מצלחת הבסיס ולהסיר מן החממה. כדי להסיר בצלחת, עיתונות קרמיקה מטה והופך את המנה בניגוד לכיוון שעון כדי לפתוח אותה צלחת הבסיס. קחו את הכלים לארון זרימה למינרית בסביבה נקייה מחיידקים להסיר את coverslips. העבר אותם סטרילית צלחות פטרי המכילות בינוני טרי או פוספט שנאגר מלוח (PBS) לבדיקה והערכה נוספות. 6. הערכה של השפעת TTFields הערה: תופעות TTFields יכול להיקבע במספר דרכים. השתמש באחת או יותר מהשיטות הבאות כדי להשוות תאים שטופלו לתאי קבוצת ביקורת: תא ספירה הסר את המדיום / PBS מכל מאכל coverslip המכיל. להוסיף 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין / EDTA לכל צלחת לדגור עד 10 דקות (כלומר, עד שהתאים מתחילים לנתק מפני השטח coverslip) בשעה 37 ° C חממה 2 CO. להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום הגידול להשלים כדי לנטרל את טריפסין מחדש להשעות את התאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. ספירת התאים באמצעות כל טכניקת ספירת תאים סטנדרטית התואמת לספור ריכוזי תא נמוכים (כלומר, בסביבות 20,000 תאים / מיליליטר). assay clonogenic פלייט מספר דומה של תאים (100-500 תאים לכל צלחת) מכל מאכל על גבי צלחות פטרי חדש, סטרילי או צלחות 6-היטב המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול שלם טרי. מדגירי CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שבועות (תלוי את המאפיינים של כל שורת תאים) עד המושבות מורכבות ~ 50 תאים נוצרים. להעריך את התאמספר מושבה על ידי מיקרוסקופ אור. הסר את המדיום ולשטוף עם PBS. הסר את PBS ולהוסיף מתנול קר כקרח (1 מ"ל). דגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או יותר. הסר את המתנול. הוספת פתרון סגול קריסטל (0.1% w / V ב 25% V / V מתנול במים) ו דגירה במשך 20 דקות. זהירות: קריסטל ויולט הוא מסרטן פוטנציאלי; כפפות להשתמש תוך כדי עבודה עם קריסטל ויולט. הסר את סגול קריסטל, לשטוף 3 פעמים עם מים deionized, ויבש באוויר. ספרו את המושבות שנוצרו בכל מנה.