腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定

インビトロアプリケーション・システムにおいて TTFields -ベースプレート皿メンテナンス水道水の下で料理や皿のカバーをすすぎます。次いで、脱イオン水及び空気乾燥フェイスダウンでリンス。 化学療法剤/薬剤は、実験前に皿に追加された場合、5％の光洗剤溶液を各皿に充填し、一晩残します。 皿の内側に洗剤の痕跡を避けるために、水道水の下で徹底的に料理をすすぎます。お皿をすすぎ、料理は、脱イオン水と空気乾燥フェイスダウンでカバーしています。 滅菌袋に彼らのカバーで清潔で乾燥したお料理を挿入します。料理は下向きで、オートクレーブ内袋を密封して配置します。 121°Cより高くないで30分間オートクレーブ。 乾燥プログラムにオートクレーブを設定し、一部はオートクレーブドアを開け、そして30分間食器を乾燥させます。 軽く70％エタノールで湿らせた布でベースプレートを拭きます。 </ ol> 2.実験セットアップ注記：このプロトコールで使用されるすべての機器および材料は、材料リストに記載されています。以下のすべてのステップは、無菌状態を維持しながら、層流キャビネット内で行う必要があります。 清潔で滅菌したTTFieldの皿とカバーを第1節で説明したように準備します。ベースプレートを70％エタノールで軽く湿らせた布で拭きます。 TTFieldsディッシュをベースプレートに取り付けます。ディッシュを静かに押し、ディッシュのリムがベースプレートの3つのピンに固定されるまで時計方向に約5 mm回転させます。各皿の底に滅菌22 mmのカバーガラス（処理プラスチックまたはガラス）を置きます。 完全増殖培地（U-87 MGおよびF98のダルベッコ変法イーグル培地; A2780およびOVCAR-3のRPMI; 材料リスト）。 注： ceLL濃度は80％-90％コンフルエントの細胞増殖を、実験の終了までに超えてはならない、細胞型および実験期間に依存します。 注意：ヒト細胞系は、生物学的ハザードを表すことができ、適切な安全対策で処理されなければなりません。 各カバースリップの中央に低下として（倍加時間に応じて、72時間の実験のために200μLで通常5,000〜20,000細胞）の細胞懸濁液200μLを配置し、皿の蓋で覆います。 細胞が接着するまでCO 2インキュベーター中で37℃でインキュベートします。一晩のインキュベーションは、この段階でも可能です。 200-または1000μLピペットを用いて滴から流体を吸引します。 穏やか各皿を充填する完全増殖培地2mlをピペット。ピペットに無菌チップを使用して、そっと時折スライドの下でキャッチ気泡を放出するためにカバースリップの端をタップ。 彼らのふたで料理を覆い、それらにインを置きますTTFields処理の開始まで37℃でCO 2インキュベーターでインキュベートする。 3. TTFieldsアプリケーション添付のTTFields皿を備えたベースプレートを冷蔵CO 2インキュベーターに移す。 注： インビトロ TTFieldsアプリケーションは熱を生成します。したがって、料理の温めを補うために、冷蔵インキュベーターが必要です。より高いTTField強度はより多くの熱を生成し、インキュベーター周囲温度をより低くする必要があります（ 表1参照）。臨床的に関連するTTFieldの強度は、TTFieldのインキュベータ温度が18〜30℃の範囲にあるときに達成されます。 フラットケーブルのメスコネクタをベースプレートに接続します。 TTFieldsジェネレータをオンに切り替えます。 TTFields in vitroアプリケーションシステムソフトウェアを起動し、実験設定を選択します。 新しい実験を定義する。 expの名前を入力してくださいerimentとコンピュータ画面上のソフトウェアのユーザーインターフェイスでの実験の所有者。各皿又はベースプレートのための周波数と目標温度を調整します。 ソフトウェアを使用してTTFieldsアプリケーションを起動します。 すべての料理が正しく接続されていることを確認してモニタに水色で表示されます。料理が赤枠で囲んだされた場合（それが正しく接続されていないことを意味する）、軽く下に押し、連絡先が復元されるまで、前後にゆっくりと回転させると料理が水色に表示されます。 最大24時間のために実行されている試験管内のアプリケーションシステムで TTFieldsを残します。 実験はそのエンドポイントに到達した場合は、ソフトウェアでのEND実験]ボタンをクリックして、実験を停止しない場合は手順5に進み、PAUSE実験をクリックしてください。 ベースプレートからフラットケーブルコネクタを外し。クリーンベンチにインキュベーターから料理をベース板を外します。 すべての皿にメディアを交換してください24時間毎にベースプレートを冷蔵インキュベーターに戻します。フラットケーブルを使用してベースプレートを発電機に接続します。 CONTINUEボタンをクリックして実験を続行します。 4.コントロールサンプル 注： TTFieldsアプリケーションを除くTTFields処理細胞と同様の条件でコントロール細胞を増殖させる。 TTFields処理したサンプルをプレーティングするために使用した同じ懸濁液および同様の表面上のプレートコントロールサンプル。 コントロール皿を37℃のCO 2インキュベーターに入れます。 TTFieldsで処理したディッシュの培地条件と一致するように、ディッシュ中の培地を24時間ごとに交換する。 5.実験終了 END EXPERIMENTをクリックした後、ソフトウェアがシステムからすべてのレコードを取得し、レコードをコンピュータに保存するのを待ちます。 REPORTSボタンを使用して、温度、電流、および抵抗のログfすべての料理が実験計画に従って処理されたことを検証するために、各ベースプレートのilesを作成しました。 注：すべてのレポートとログは実験終了後にコンピュータに保存され、いつでも確認することができます。 TTFieldsジェネレータをオフにします。 フラットケーブルをベースプレートから外し、保育器から取り出します。 セラミック製の皿を取り外すには、押し下げて皿を反時計回りに回してベースプレートからロックを解除します。 皿を層流キャビネットに入れ、カバースリップを無菌的に除去する。さらなる検査と評価のために新鮮な培地またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む滅菌ペトリ皿に移す。 6.TTFieldの効果の評価注：TTFieldの効果は、いくつかの点で決定できます。以下の方法の1つ以上を使用して、処理細胞を未処理の対照細胞と比較する： 細胞数各カバースリップ含有ディッシュから培地/ PBSを除去する。 各ディッシュに0.25％トリプシン/ EDTA 0.5 mLを添加し、CO2インキュベーター内で37℃で10分間（ すなわち、細胞がカバーガラス表面から剥がれ始めるまで）インキュベートする。 0.5mLの完全増殖培地を添加してトリプシンを中和し、上下に穏やかにピペッティングすることによって細胞を再懸濁する。 低細胞濃度（ すなわち、約20,000細胞/ mL）を計数することと適合する標準的な細胞計数技術を用いて細胞を数える。 クローン化アッセイ各ディッシュから同様の数の細胞（1皿あたり100-500細胞）を、新しい、無菌ペトリ皿または2mLの新鮮な完全増殖培地を含む6ウェルプレートにプレートする。 約50個の細胞からなるコロニーが形成されるまで、37℃のCO 2インキュベーターで1〜3週間インキュベートする（各細胞株の特性に応じて）。細胞を評価する光顕微鏡によるコロニーあたりの数。 培地を除去し、PBSですすいでください。 PBSを除去し、氷冷メタノール（1 ml）を加えます。 10分以上のために-20°Cでインキュベートします。 メタノールを除去します。 クリスタルバイオレット溶液（水中25％v / vのメタノール中のw / vの0.1％）を添加し、20分間インキュベートします。 注意：クリスタルバイオレットは、潜在的な発がん性物質です。クリスタルバイオレットでの作業中に手袋を使用しています。 、クリスタルバイオレットを除去する脱イオン水で3回洗浄し、そして空気乾燥。 各皿に形成されたコロニーを数えます。