Determinação da Frequência Inibitória Óptima para Células Cânceras Utilizando Campos de Tratamento Tumoral (TTFields)
Summary
Tumorais Tratar Campos (TTFields) são uma modalidade de tratamento anti-tumoral eficaz entregue através da aplicação contínua, não-invasivo de baixa intensidade, de frequência intermédia, alternando os campos eléctricos. TTFields aplicação de linhas de células utilizando um sistema in vitro de aplicação TTFields permite a determinação da frequência óptima que conduz à maior redução nas contagens de células.
Abstract
Os Campos de Tratamento Tumoral (TTFields) são uma modalidade de tratamento eficaz administrada através da aplicação contínua e não invasiva de campos eléctricos alternados de baixa intensidade (1-3 V / cm) na gama de frequências de várias centenas de kHz. O estudo de TTFields em cultura de tecidos é realizado utilizando o sistema de aplicação TTFields in vitro , que permite a aplicação de campos elétricos de freqüências e intensidades variáveis a placas de Petri cerâmicas com uma constante dielétrica elevada (Ɛ> 5.000). Linhas celulares cancerosas colocadas em lamínulas no fundo das placas de Petri cerâmicas são submetidas a TTFields fornecidos em duas direcções ortogonais a várias frequências para facilitar os testes de resultados de tratamento, tais como contagens de células e ensaios clonogénicos. Os resultados apresentados neste relatório demonstram que a frequência óptima dos TTFields com respeito à contagem de células e ensaios clonogénicos é de 200 kHz para ambas as células de ovário e glioma.
Introduction
Campos tratamento de tumores (TTFields) são uma modalidade anti-mitótico para o tratamento de glioblastoma multiforme e potencialmente outros tipos de cancro. Os campos são distribuídos através da aplicação contínua de baixa intensidade (1-3 V / cm), de frequência intermédia (100-500 kHz), alternando campos eléctricos para a região do tumor 1, 2. TTFields aplicação in vitro e in vivo foi demonstrado que inibem tanto o crescimento de várias linhas de células cancerosas e a progress dos tumores em vários modelos de tumores animais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Ensaios clínicos e estudos-piloto randomizados maiores em pacientes com tumores sólidos, incluindo o glioblastoma e o cancro do pulmão de células não pequenas, têm demonstavaliaram a segurança e a eficácia da aplicação contínua TTFields 8, 9, 10. A eficácia dos TTFields verificou-se ser: (1) dependente de frequência, com frequências óptimas específicas que conduzem à maior redução nas contagens de células de linhas celulares de diferentes origens 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) intensidade-dependente, com um limiar mínimo para a actividade em cerca de 1 V / cm e as intensidades mais potentes superiores 1, 2, 7, 11 do campo eléctrico; (3) aumenta quando a duração do tratamento foi mais 5; e (4) superior quando 2 TTFields direccionais foram aplicados perpendicularmente a cada other, em comparação com os campos eléctricos aplicados a partir de uma única direcção 1. Com base nas conclusões acima, TTFields pode ser aplicada a pacientes durante longos períodos, utilizando 2 conjuntos de matrizes de transdutores localizados sobre a pele do paciente para maximizar as intensidades do campo eléctrico no leito tumoral 12, 13.
O estudo dos efeitos de TTFields sobre as células cancerosas in vitro actualmente proporciona a única forma de determinar a frequência óptima para se aplicar a um tipo específico de tumor. Teste para a frequência óptima exige um dispositivo que permite a aplicação de diferentes frequências na faixa de 100-500 kHz e a intensidade de até 3 V / cm de raiz quadrada média (RMS) à cultura de células. Como aplicação TTFields produz calor, o sistema de aplicação requer a capacidade para dissipar o calor excessivo, mantendo um controlo apertado sobre a temperatura.
Vários dispositivos were desenvolvidos ao longo dos anos para permitir a aplicação TTFields a culturas de células 1, 2, 5, 14, 15, 16. Em todos estes dispositivos, os eléctrodos usados foram isolados, a fim de evitar as ressalvas envolvidas com a utilização de eléctrodos condutores, tais como a troca de electrões na superfície do eléctrodo e a libertação de iões metálicos tóxicos para o meio de um. A principal diferença entre os vários sistemas de aplicação TTFields testados é do tipo de isolamento do eléctrodo utilizado, quer com eléctrodos feitos de fios de metal isolados com uma película fina de isolador 2, 14, 15, 16 ou com um material de alta dieléctrica constante (por exemplo, magnésio chumbo titanat niobato de chumboe (PMN-PT)) 6. Embora os eléctrodos fios isolados oferecem uma solução relativamente simples e de baixo custo para aplicação TTFields, eles são muitas vezes limitados pela alta tensão necessária para atingir eficazes intensidades de campo eléctrico superior ao limiar de 1 V / cm e pela superfície disponível para o plaqueamento de células, medida que a distância entre os eléctrodos é relativamente pequena. Sistemas baseados em eletrodos isolados usando um material de alta dielétrico-constante requerem capacidades de design e fabricação especiais, mas eles não precisam de alta tensão e pode oferecer uma área maior para o crescimento celular entre os eletrodos.
O sistema in vitro de aplicação TTFields utilizado neste trabalho pertence a esta última classe de sistemas, com a unidade do núcleo ser uma placa de Petri (TTFields prato, ver Figura 1) composto de alta-dieléctrica constante de cerâmica (isto é, PMN-PT). Dois pares de eléctrodos são impressos perpendicularmente sobre a parede externasl de um prato TTFields para permitir a aplicação de campos eléctricos a partir de 2 direcções. Os eléctrodos são ligados a um gerador de forma de onda sinusoidal e um amplificador, que permitem a aplicação TTFields na gama de 50-500 kHz. De modo a se dissipar o calor excessivo, os pratos TTFields são mantidos dentro de uma incubadora refrigerada, com a temperatura do meio-controle realizados utilizando a monitorização constante da temperatura do prato e ajustes para a voltagem aplicada pelo sistema. Na prática, a configuração da incubadora para uma temperatura mais baixa iria conduzir a maiores intensidades de campo eléctrico, tal como o sistema aumenta a tensão até que a temperatura alvo no interior do prato é conseguido. A diferença entre a temperatura dentro do prato e a temperatura da incubadora pode levar a alguma evaporação, dependendo dos gradientes de temperatura; Assim, o meio de cultura deve ser substituído a cada 24 h para manter as condições de crescimento adequados.
O protocolo abaixodescreve o procedimento experimental para optimizar a aplicação de frequências TTFields para as células cancerosas de modo a que uma redução máxima no número de células e uma redução no potencial das células sobreviventes para formarem colónias são alcançados.
Protocol
Representative Results
Discussion
TTFields são uma modalidade anti-tumor emergente baseado na aplicação contínua de campos eltricos alternados devidamente afinados 1, 2, 8, 9, 10, 17. Maximizando a eficácia anti-tumoral é um resultado desejável para todas as modalidades de tratamento. Assim, "lutando" para cada por cento adicional de inibição do crescimento de células cancerosas podem ter um efeito significativo sobre o resultado clínico a longo prazo para os pacientes. Isto é devido à natureza contínua necessária de aplicação TTFields eo efeito cumulativo resultante. Maximizando a aplicação TTFields pode ser conseguido de várias maneiras: (1) aumentar a intensidade do campo eléctrico 1, 7, (2) a duração do tratamento alongamento 5, (3) encontrar o mais eficaz associaçno com outras modalidades de tratamento 18, 19, e (4), que define a frequência óptima 1, 2, 4, 6, 7. Maximizando a intensidade do campo eléctrico no local do tumor é conseguida através da optimização da localização das matrizes sobre a pele do paciente; isto permite a entrega da intensidade do campo máxima para o tumor com base na anatomia individual do paciente 20. Alongamento duração do tratamento depende principalmente da adesão do paciente ao tratamento (por, pelo menos, 18 h por dia) 17. Encontrar a combinação certa com outras terapias e determinar a frequência óptima depende fortemente de resultados in vitro, como não há marcadores validados para TTFields os resultados do tratamento são actualmente disponíveis. Neste trabalho, nós descrevemos o p experimentalPROCEDIMENTOS necessária para determinar a frequência óptima para TTFields linhas de células cancerosas usando o sistema in vitro de TTFields aplicação. Os métodos descritos aqui podem potencialmente ser utilizados para pesquisar a combinação de outras modalidades de tratamento do cancro (por exemplo, agentes de quimioterapia ou irradiação) com TTFields e para determinar a frequência óptima para administração TTFields para cada tratamento combinado específico.
De acordo com publicações anteriores, os resultados apresentados aqui demonstram que a frequência óptima para o tratamento de ambas as células de glioma e culas de cancro do ovário é de 200 kHz 1, 7. Neste trabalho, nós demonstramos pela primeira vez que a frequência TTFields ideal para reduzir o potencial clonogénico está relacionado com a frequência que leva para o efeito citotóxico máximo. Os métodos utilizados neste trabalho para quantificar os efeitos de TTFields (ou seja, citotóxica e clonogénico) umre apenas duas das muitas possíveis ensaios de ponto final padrão para avaliar os resultados do tratamento. Testes adicionais resultado de tratamento incluem: (1) de fixação, coloração, e de montar as lamelas em que as células são plaqueadas sobre um microscópio para a visualização das estruturas intracelulares; (2) realizar ensaios de extractos de proteína e ARN, quer a partir dos próprios pratos TTFields ou depois de transferir a lamela a um novo prato descartável; e (3) trypsinizing células coradas para citometria de fluxo de análise.
planejamento experimental cuidadosa terá impacto sobre os resultados do tratamento após a entrega do TTFields. Os passos chave incluem a garantia de que a proliferação de células ao longo da experiência não conduz ao crescimento excessivo e utilizando a intensidade do campo eléctrico apropriado, como intensidades que são demasiado elevados quando aplicada a linhas de células sensíveis irão resultar em demasiado poucas células para os ensaios necessários para determinar a frequência óptima. Por outro lado, TTFields aplicadas em intensidades extremamente baixasEm linhas celulares menos sensíveis resultará em pequenos efeitos que podem ser mascarados por variação inerente. Os registros de tratamento devem ser examinados para obter informações valiosas sobre estabilidade de temperatura, correntes elétricas e resistência para cada prato durante todo o experimento. A substituição de pratos defeituosos no início do tratamento e a exclusão de dados de um prato que não satisfizesse os parâmetros de tratamento desejáveis minimizarão a variabilidade entre repetições.
Em resumo, os TTFields são uma modalidade de tratamento anticancerígeno emergente que já demonstrou eficácia e segurança em contextos clínicos 8 , 9 , 10 . O teste de TTFields numa configuração in vitro utilizando os protocolos aqui descritos pode permitir a optimização dos parâmetros de tratamento TTFields no contexto clínico e pode alargar a nossa compreensão do mecanismo de acção subjacente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autores não têm reconhecimentos.
Materials
| inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
| Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
| Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
| Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
| Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
| Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
| Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
| Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
| PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
| A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
| F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
| U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
| Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |
References
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