Die Bestimmung der optimalen inhibitorische Frequenz für Krebszellen mit Tumor Behandlung Fields (TTFields)
Summary
Tumor Behandlung Fields (TTFields) sind eine wirksame anti-Tumor-Behandlungsmodalität über die kontinuierliche, nichtinvasive Anwendung von geringer Intensität geliefert, Zwischenfrequenz, elektrische Wechselfelder. TTFields Anwendung auf Zelllinien unter Verwendung einer in vitro TTFields Systemanwendung ermöglicht die Bestimmung der optimalen Frequenz , die in Zellzählungen zur höchsten Reduktion führt.
Abstract
Tumor Behandlung Fields (TTFields) ist eine wirksame Behandlungsmethode über die kontinuierliche, nichtinvasive Anwendung von geringer Intensität geliefert (1-3 V / cm), elektrische Wechselfelder in dem Frequenzbereich von einigen hundert kHz. Die Studie der TTFields in Gewebekultur in vitro – Anwendungssystem der TTFields durchgeführt, die für die Anwendung von elektrischen Feldern mit unterschiedlichen Frequenzen und Intensitäten auf keramische Petrischalen mit einer hohen Dielektrizitätskonstante (Ɛ> 5000) ermöglicht. Kanzerösen Zelllinien ausplattiert auf Deckgläser an der Unterseite der Keramikpetrischalen werden auf TTFields in zwei orthogonalen Richtungen bei verschiedenen Frequenzen zugezogen Behandlungsergebnis Tests, wie Zellzählungen und klonogenen Assays zu erleichtern. Die Ergebnisse in diesem Bericht zeigen, dass die optimale Frequenz der TTFields in Bezug auf beide Zellzählungen und klonogenen Assays 200 kHz für beide Eierstock- und Gliomzellen ist.
Introduction
Tumor Behandlung Fields (TTFields) ist eine anti-mitotische Modalität für die Behandlung von Glioblastoma multiforme und möglicherweise anderen Krebsarten. Die Felder werden durch die kontinuierliche Anwendung von geringer Intensität (1-3 V / cm), Zwischenfrequenz (100-500 kHz), elektrische Wechselfelder in dem Bereich des Tumors , 1, 2 geliefert werden . TTFields Anwendung in vitro und in vivo gezeigt wurde in mehreren Tiertumormodellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 sowohl das Wachstum von verschiedenen Krebszelllinien und die Progression der Tumoren zu hemmen. Pilot klinische Studien und größere randomisierten Studien bei Patienten mit soliden Tumoren, einschließlich Glioblastom und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, hat demonstdie Sicherheit und Wirksamkeit von kontinuierlicher TTFields Anwendung 8, 9, 10 bewertet. Die Wirksamkeit der TTFields wurde gefunden zu sein: (1) frequenzabhängig ist , mit spezifischen optimalen Frequenzen auf die höchste Verringerung der Zellzahlen von Zelllinien aus unterschiedlichen Ursprüngen führenden 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) die elektrische Feldstärke abhängig, mit einem minimalen Schwellenwert für die Aktivität bei etwa 1 V / cm und stärker höheren Intensitäten 1, 2, 7, 11; (3) verbessert , wenn die Behandlungsdauer länger war 5; und (4) höher ist, als 2-Wege-TTFields wurde senkrecht zu jeder OTH angewandtIm Vergleich zu elektrischen Feldern aus einer einzigen Richtung 1 . Basierend auf den obigen Befunden können TTFields auf Patienten für lange Zeitdauern angewendet werden, wobei 2 Sätze von Wandlerarrays verwendet werden, die auf der Haut der Patienten lokalisiert sind, um die elektrischen Feldintensitäten im Tumorbett 12 , 13 zu maximieren.
Das Studium der Effekte von TTFields auf Krebszellen in vitro bietet derzeit die einzige Möglichkeit, die optimale Häufigkeit zu bestimmen, um auf einen bestimmten Tumortyp anzuwenden. Die Prüfung auf die optimale Frequenz erfordert ein Gerät, das die Anwendung unterschiedlicher Frequenzen im Bereich von 100-500 kHz und bei Intensitäten von bis zu 3 V / cm Wurzel mittlerem Quadrat (RMS) zur Zellkultur ermöglicht. Da die TTFields-Anwendung Wärme erzeugt, erfordert das Applikationssystem die Fähigkeit, übermäßige Hitze zu zerstreuen, während die Kontrolle über die Temperatur beibehalten wird.
Mehrere Geräte were im Laufe der Jahre entwickelte für TTFields Anwendung auf Zellkulturen 1, 2, 5, 14, 15, 16 zu ermöglichen. In allen diesen Vorrichtungen sind die verwendeten Elektroden wurden isoliert , um die Einschränkungen bei der Verwendung von leitfähigen Elektroden, wie Elektronenaustausch an der Elektrodenoberfläche und die Freisetzung von toxischen Metallionen in das Medium 1 beteiligt zu vermeiden. Der Hauptunterschied zwischen den verschiedenen Systemen TTFields Anwendung getestet ist die Art der Elektrodenisolation verwendet, wobei entweder Elektroden aus Metalldrähten isoliert mit einem dünnen Film aus einem Isolator 2, 14, 15, 16 oder mit einem hohen Dielektrizitätskonstante Material (zB aus, Bleimagnesiumniobat-Blei-Titanate (PMN-PT)) 6. Während die isolierte Drahtelektrode eine relativ einfache und kostengünstige Lösung für TTFields Anwendung bietet, werden sie durch die Hochspannungs oft begrenzt erforderlich effektive elektrische Feldstärken über der 1 V / cm Schwelle und durch die Oberfläche für die Zell Plattieren zur Verfügung zu erreichen, als der Abstand zwischen den Elektroden ist relativ klein. Systeme auf Basis von Elektroden mit einem hohen Dielektrizitätskonstante Material erfordern eine spezielle Konstruktion und Fertigung Fähigkeiten isoliert, aber sie nicht zu hohen Spannung benötigen und eine größere Fläche für das Zellwachstum zwischen den Elektroden bieten.
Die TTFields in vitro – Anwendungssystem in dieser Arbeit verwendet , gehört zu der letzteren Klasse von Systemen, wobei die Kerneinheit eine Petrischale ist (TTFields dish, siehe Abbildung 1) , die aus hohem Dielektrizitätskonstante Keramik (dh PMN-PT). Zwei Paare von Elektroden sind senkrecht auf dem äußeren wal gedrucktLs einer TTFields Schale, um die Anwendung von elektrischen Feldern aus 2 Richtungen zu ermöglichen. Die Elektroden sind mit einem sinusförmigen Wellenformgenerator und einem Verstärker verbunden, die eine TTFields-Applikation im Frequenzbereich von 50-500 kHz ermöglichen. Um die übermäßige Hitze zu zerstreuen, werden die TTFields-Geschirr in einem gekühlten Inkubator gehalten, wobei die mittlere Temperaturregelung unter ständiger Überwachung der Schalentemperatur und der Einstellung der vom System angelegten Spannung erfolgt. In der Praxis würde die Einstellung des Inkubators auf eine niedrigere Temperatur zu höheren elektrischen Feldstärken führen, da das System die Spannung erhöht, bis die Zieltemperatur innerhalb der Schale erreicht ist. Der Unterschied zwischen der Temperatur innerhalb der Schale und der Inkubatortemperatur kann je nach Temperaturgradienten zu einer gewissen Verdampfung führen; Daher muss das Kulturmedium alle 24 h ausgetauscht werden, um angemessene Wachstumsbedingungen zu erhalten.
Das Protokoll untenBeschreibt das experimentelle Verfahren zur Optimierung der Anwendung von TTFields-Frequenzen auf Krebszellen, so dass eine maximale Reduktion der Zellzahl und eine Verringerung des Potentials der überlebenden Zellen zur Bildung von Kolonien erreicht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
TTFields sind eine aufkommende Anti-Tumor-Modalität, die auf der kontinuierlichen Anwendung von richtig abgestimmten elektrischen Wechselfeldern 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 basiert. Die Maximierung der Anti-Tumor-Wirksamkeit ist ein wünschenswertes Ergebnis für alle Behandlungsmodalitäten. So kann "Kämpfen" für jeden weiteren Prozentsatz der Krebszellwachstumshemmung einen signifikanten Einfluss auf das langfristige klinische Ergebnis für Patienten haben. Dies ist wegen der erforderlichen kontinuierlichen Natur der TTFields Anwendung und der daraus resultierenden kumulativen Effekt. Die Maximierung der TTFields-Applikation kann auf mehrere Arten erreicht werden: (1) Erhöhung der elektrischen Feldstärke 1 , 7 , (2) Verlängerung der Behandlungsdauer 5 , (3) Finden der effektivsten Kombinationenauf mit anderen Behandlungsmodalitäten 18, 19, und (4) definiert , um die optimale Frequenz von 1, 2, 4, 6, 7. Maximieren der elektrische Feldstärke an der Stelle des Tumors wird durch die Optimierung der Position der Arrays auf der Haut des Patienten erreicht wird; Dies erlaubt die Lieferung der maximalen Feldstärke an den von der individuellen Anatomie des Patienten basierend Tumor 20. Eine Verlängerung der Behandlungsdauer beruht vor allem auf dem Patienten – Compliance mit der Behandlung (für mindestens 18 Stunden pro Tag) 17. Das Finden der richtigen Kombination mit anderen Therapien und die optimale Frequenz Bestimmung stützt sich stark auf in – vitro – Ergebnisse, da keine validierten Marker für TTFields Behandlungsergebnisse derzeit verfügbar sind. In dieser Arbeit haben wir die experimentellen p skizziertenVerwendung des in vitro TTFields Anwendungssystem ERFäHRT erforderlich , um die optimale Frequenz für TTFields Krebszelllinien zu bestimmen. Die hier beschriebenen Methoden können potentiell die Kombination von anderen Krebsbehandlungsmethoden zu screenen , verwendet werden ( zum Beispiel chemotherapeutischen Mitteln oder Bestrahlung) mit TTFields und die optimale Frequenz für TTFields Verabreichung für jede spezifische kombinierte Behandlung zu bestimmen.
Im Einklang mit früheren Veröffentlichungen zeigen die hier gezeigten Ergebnisse , dass die optimale Frequenz für die Behandlung sowohl von Gliomzellen und Eierstockkrebszellen ist 200 kHz 1, 7. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, zum ersten Mal, dass die optimale TTFields Frequenz des klonogenen Potential zu reduzieren, ist mit der Frequenz zugeordnet ist, auf die maximale zytotoxische Wirkung führt. Die Verfahren , die in dieser Arbeit verwendet zur Quantifizierung der Auswirkungen von TTFields (dh zytotoxische und klonogenen) are nur zwei von vielen möglichen Standard-Endpunkt-Assays Behandlungsergebnisse zu bewerten. Zusätzliche Behandlungsergebnis Tests umfassen: (1) Fixieren, Färben und die Montage der Deckgläser, auf dem die Zellen über ein Mikroskop zur Visualisierung von intrazellulären Strukturen plattiert sind; (2) Durchführen von Assays für Protein und RNA-Extrakte, entweder aus den TTFields Speisen selbst oder nach dem Deckglas auf einen neuen Einwegschale übertragen; und (3) Trypsinisierung für die Durchflusszytometrie-Analyse gefärbte Zellen.
Eine sorgfältige experimentelle Planung werden die Behandlungsergebnisse nach der Lieferung von TTFields auswirken. Die wichtigsten Schritte sind sicherzustellen, dass die Zellproliferation während des Experiments nicht zu Überwucherung führt und unter Verwendung der geeignete elektrische Feldstärke, als Intensitäten, die zu hoch sind, wenn sie empfindliche Zelllinien angewandt wird in allzu wenig Zellen führen für die erforderlichen Tests zu bestimmen, die optimale Frequenz. Im Gegensatz dazu angewendet TTFields bei sehr niedrigen Intensitätenauf weniger empfindlichen Zelllinien werden in kleinen Wirkungen führen, die durch inhärente Variation maskiert werden kann. Die Behandlungsprotokolle sollten wertvolle Informationen über die Temperaturstabilität, elektrische Ströme und Widerstand für jeden und jedes Gericht während des gesamten Experiments untersucht werden. Ersetzen fehlerhafte Gerichte zu Behandlungsbeginn und ohne Daten von einem Gericht, das die erwünschten Behandlungsparameter nicht erfüllt haben wird Variabilität zwischen den Replikaten minimieren.
Zusammengefasst TTFields ist ein aufstrebender Krebsbehandlungsmethode , die bereits die Wirksamkeit und Sicherheit im klinischen Umfeld unter Beweis gestellt hat 8, 9, 10. Testen TTFields in einer in – vitro – Einstellung unter Verwendung der hier beschriebenen Protokolle können zur Optimierung des TTFields Behandlungsparameters im klinischen Umfeld ermöglichen und kann unser Verständnis des zugrunde liegenden Wirkmechanismus erweitern.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
| Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
| Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
| Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
| Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
| Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
| Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
| Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
| PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
| A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
| F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
| U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
| Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |
References
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