Het bepalen van de optimale frequentie voor remmende kankercellen gebruiken Tumor Behandeling Fields (TTFields)
Summary
Tumorbehandelingsvelden (TTFields) zijn een effectieve anti-tumorbehandelingsmodaliteit die wordt geleverd via de continue, niet-invasieve toepassing van lage intensiteit, intermediaire frequentie, afwisselende elektrische velden. TTFields applicatie op cellijnen door gebruik te maken van een TTFields in vitro applicatiesysteem maakt het mogelijk de optimale frequentie te bepalen die leidt tot de hoogste reductie in celtellingen.
Abstract
Tumor Treating Fields (TTFields) zijn een effectieve behandelingsmodaliteit die wordt geleverd via de continue, niet-invasieve toepassing van lage intensiteit (1-3 V / cm), alternerende elektrische velden in het frequentiebereik van enkele honderden kHz. De studie van TTFields in weefselkweek wordt uitgevoerd met behulp van het in vitro applicatiesysteem TTFields, waarmee de toepassing van elektrische velden van verschillende frequenties en intensiteiten wordt toegepast op keramische Petri-schotels met een hoge diëlektrische constante (Ɛ> 5000). Kankerachtige cellijnen die op de dekglazen op de bodem van de keramische Petri-schotels zijn geplateerd, worden onderworpen aan TTFields die in twee orthogonale richtingen worden afgeleverd bij verschillende frequenties om de uitkomsttesten van de behandeling te vergemakkelijken, zoals celtellingen en clonogene analyses. De resultaten die in dit rapport worden gepresenteerd, tonen aan dat de optimale frequentie van de TTFields met betrekking tot zowel celtellingen als clonogene tests 200 kHz is voor zowel eierstokken als gliomacellen.
Introduction
Tumor Behandeling Fields (TTFields) zijn anti-mitotische modaliteit voor de behandeling van glioblastoma multiforme en mogelijk andere kankersoorten. De velden worden geleverd via de voortdurende toepassing van lage intensiteit (1-3 V / cm), middenfrequent (100-500 kHz), wisselende elektrische velden om het gedeelte van de tumor 1, 2. TTFields toepassing in vitro en in vivo werd aangetoond dat zowel de kankerachtige groei van verschillende cellijnen en de progressie van de tumoren in verschillende dierlijke tumormodellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 remmen. Pilot klinische proeven en grotere gerandomiseerde studies bij patiënten met solide tumoren, met inbegrip van glioblastoma en niet-kleincellige longkanker, hebben demonstbeoordeelden de veiligheid en werkzaamheid van continue TTFields aanvraag 8, 9, 10. De werkzaamheid van de TTFields bleek te zijn: (1) frequentieafhankelijke, specifieke optimale frequenties die tot de grootste vermindering van de celtellingen van cellijnen van verschillende oorsprong 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) elektrische veldsterkte-afhankelijk, met een minimale drempel voor activiteit bij ongeveer 1 V / cm en krachtiger hogere intensiteiten 1, 2, 7, 11; (3) versterkt wanneer de behandelingsduur langer was 5; en (4) hoger wanneer 2 richtbare TTFields zijn loodrecht aangebracht op elke other, in vergelijking met elektrische velden aangebracht vanuit een enkele richting 1. Op basis van bovenstaande bevindingen kan TTFields worden toegepast bij patiënten voor langere duur gebruik van 2 sets van omzettergroeperingen gelokaliseerd op de huid van de patiënt op de elektrische veldsterkte in de tumor bed 12, 13 te maximaliseren.
Het bestuderen van de effecten van TTFields voor kankercellen in vitro verschaft momenteel de enige manier om de optimale frequentie voor een specifiek tumortype vast. Testen op de optimale frequentie is een apparaat dat voorziet in de toepassing van verschillende frequenties in het bereik van 100-500 kHz en intensiteit tot 3 V / cm kwadratisch gemiddelde (RMS) aan de celkweek. Zoals TTFields applicatiewarmtewisselaar produceert het toepassingssysteem vereist het vermogen om overmatige warmte af te voeren terwijl strikte beheersing van de temperatuur.
Verschillende apparaten werE ontwikkeld door de jaren om TTFields aan te geven op celculturen 1 , 2 , 5 , 14 , 15 , 16 . In al deze inrichtingen werden de gebruikte elektroden geïsoleerd om de caveats die betrokken zijn bij het gebruik van geleidende elektroden, zoals elektronenuitwisseling bij het elektrodeoppervlak en de afgifte van giftige metaalionen in het medium 1 te vermijden. Het belangrijkste verschil tussen de verschillende geteste TTFields applicatiesystemen is het type elektrode-isolatie dat wordt gebruikt, met ofwel elektroden gemaakt van metalen draden die zijn geïsoleerde met een dunne film van isolator 2 , 14 , 15 , 16 of met een hoog diëlektrische constante materiaal ( bijv. Lood magnesium niobaat-lood titanaate (PMN-PT)) 6. Terwijl de geïsoleerde draadelektroden bieden een relatief eenvoudige en rendabele oplossing voor TTFields toepassing worden vaak beperkt door de hoge spanning hiervoor noodzakelijke effectieve elektrische veldsterkten boven 1 V / cm drempel en door de voor cellen platerenoppervlakte, wanneer de afstand tussen de elektroden is relatief klein. Op basis van elektroden geïsoleerd met een hoge diëlektrische constante materiaal vereisen speciale ontwerp en fabricage vermogens, maar ze vereisen geen hoge spanning en kan een groter gebied voor celgroei tussen de elektroden bieden.
De TTFields in vitro toepassingssysteem gebruikt in dit werk behoort tot deze klasse van systemen, waarbij de kerneenheid als een petrischaal (TTFields schotel, zie figuur 1) samengesteld uit hoge diëlektrische constante keramiek (bijv PMN-PT). Twee paren elektroden loodrecht gedrukt op de buitenste walLs van een TTFields schotel om de toepassing van elektrische velden vanaf 2 richtingen mogelijk te maken. De elektroden zijn verbonden met een sinusvormige golfvormgenerator en een versterker, die de toepassing van TTFields in het frequentiebereik van 50-500 kHz mogelijk maakt. Om de overmatige warmte te ontlopen, worden de TTFields-schotels in een gekoelde incubator gehouden, waarbij de gemiddelde temperatuurregeling wordt uitgevoerd met behulp van constante bewaking van de schoteltemperatuur en aanpassingen aan de door het systeem toegepaste spanning. In de praktijk zou de incubator naar een lagere temperatuur leiden tot hogere elektrische veldintensiteiten, aangezien het systeem de spanning verhoogt tot de doeltemperatuur binnen de schotel is bereikt. Het verschil tussen de temperatuur binnen de schotel en de incubatortemperatuur kan leiden tot enige verdamping, afhankelijk van de temperatuurgradiënten; Daarom moet het kweekmedium elke 24 uur vervangen worden om voldoende groeivoorwaarden te handhaven.
Het onderstaande protocolbeschrijft de experimentele procedure voor de toepassing van TTFields frequenties kankercellen te optimaliseren, zodat een maximale vermindering celtelling en een vermindering van het vermogen van de overlevende cellen onder vorming van kolonies worden bereikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
TTFields zijn een opkomende anti-tumor modaliteit gebaseerd op de continue toepassing van goed afgestemde alternerende elektrische velden 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 . Het maximaliseren van anti-tumor werkzaamheid is een wenselijk resultaat voor alle behandelingsmodaliteiten. Zo kan "vechten" voor elk extra percentage van de remming van kankercelgroei een significant effect hebben op het langdurige klinische resultaat voor patiënten. Dit komt door de vereiste continue aard van TTFields applicatie en het daaruit voortvloeiende cumulatieve effect. Maximale TTFields applicatie kan op verschillende manieren worden bereikt: (1) het verhogen van de elektrische veldintensiteit 1 , 7 , (2) verlenging van de behandelingsduur 5 , (3) het vinden van de meest effectieve combinatiAan met andere behandelingsmodaliteiten 18 , 19 en (4) die de optimale frequentie 1 , 2 , 4 , 6 , 7 definiëren. Het maximaliseren van de elektrische veldintensiteit op de plaats van de tumor wordt bereikt door de locatie van de arrays op de patiënthuid te optimaliseren; Dit zorgt voor de levering van de maximale veldintensiteit aan de tumor op basis van de individuele anatomie van de patiënt 20 . Verlenging van de behandelingsduur hangt voornamelijk af van de naleving van de patiënt bij de behandeling (voor minstens 18 uur per dag) 17 . Het vinden van de juiste combinatie met andere therapieën en het bepalen van de optimale frequentie hangt sterk af van in vitro resultaten, aangezien er geen gevalideerde markers voor TTFields behandelingsresultaten momenteel beschikbaar zijn. In dit werk hebben we de experimentele pRocedures nodig om de optimale TTFields frequentie voor kankercellijnen te bepalen met behulp van het TTFields in vitro applicatiesysteem. De hier beschreven methoden kunnen mogelijk worden gebruikt om de combinatie van andere kankerbehandelingsmodaliteiten (bijvoorbeeld chemotherapiemiddelen of bestraling) met TTFields te screenen en om de optimale frequentie voor TTFields toediening voor elke specifieke gecombineerde behandeling te bepalen.
In overeenstemming met eerdere publicaties blijkt dat de resultaten die hier worden getoond, aantonen dat de optimale frequentie voor de behandeling van zowel gliomacellen als eierstokkankercellen 200 kHz 1 , 7 is . In dit werk hebben we voor het eerst aangetoond dat de optimale TTFields frequentie om het clonogene potentieel te verminderen in verband staat met de frequentie die leidt tot het maximale cytotoxische effect. De methoden die in dit werk worden gebruikt om de effecten van TTFields ( dwz cytotoxische en clonogene) te kwantificeren aRe slechts twee van de vele mogelijke standaard endpoint assays om de behandelingsresultaten te evalueren. Aanvullende behandelingen uitkomst tests omvatten: (1) vaststelling, kleuring en montage van de dekglazen waarop de cellen zijn geplateerd over een microscoop voor het visualiseren van intracellulaire structuren; (2) het uitvoeren van assays van eiwit- en RNA-extracten, van de TTFields zelf, of na het overbrengen van de deklaag naar een nieuwe wegwerpschotel; En (3) trypsiniserende cellen gekleurd voor flowcytometrie analyse.
Een zorgvuldige experimentele planning zal de behandelingsresultaten beïnvloeden na de levering van TTFields. De belangrijkste stappen zijn erop toe te zien dat de cel proliferatie door het experiment niet tot overgroei leidt en de juiste elektrische veldintensiteit gebruikt, aangezien intensiteiten die te hoog zijn wanneer ze op gevoelige cellijnen worden toegepast, resulteren in te weinig cellen voor de vereiste analyses om te bepalen De optimale frequentie. Omgekeerd werden TTFields toegepast bij zeer lage intensiteitenOp minder gevoelige cellijnen zal resulteren in kleine effecten die kunnen worden gemaskerd door inherente variatie. De behandelingslogboeken moeten worden onderzocht voor waardevolle informatie over temperatuurstabiliteit, elektrische stromingen en weerstand voor elk gerecht gedurende het experiment. Vervanging van defecte gerechten bij het starten van de behandeling en het uitsluiten van gegevens uit een schotel dat niet aan de gewenste behandelingsparameters voldoet, vermindert de variabiliteit tussen replicaten.
Samenvattend zijn TTFields een opkomende behandeling tegen kankerbehandeling die reeds werkzaamheid en veiligheid heeft getoond in klinische instellingen 8 , 9 , 10 . Het testen van TTFields in een in vitro- omgeving met behulp van de hier beschreven protocollen kan de optimalisatie van TTFields-behandelingsparameters in de klinische omgeving mogelijk maken en ons begrip van het onderliggende werkingsmechanisme kunnen verbreden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
| Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
| Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
| Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
| Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
| Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
| Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
| Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
| PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
| A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
| F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
| U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
| Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |
References
- Kirson, E. D., et al. Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).
- Kirson, E. D., et al. Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields. Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).
- Gera, N., et al. Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Giladi, M., et al. Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields. Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).
- Giladi, M., et al. Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells. Sci Rep. 5, 18046 (2015).
- Giladi, M., et al. Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo. Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).
- Voloshin, T., et al. Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo. Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).
- Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &, D. A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).
- Stupp, R., et al. Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).
- Stupp, R., et al. NovoTTF-100A versus physician’s choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality. Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).
- Kanner, A. A., et al. Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician’s choice chemotherapy. Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).
- Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &, J. P. Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma. Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).
- Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas. Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).
- Kim, E. H., et al. Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation. Oncotarget. , (2016).
- Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &, M. Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis. Oncotarget. , (2016).
- Pavesi, A., et al. Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application. Sci Rep. 6, 26584 (2016).
- Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation. Cancer Med. , (2015).
- Kirson, E. D., et al. Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields). BMC Med Phys. 9, (2009).
- Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &, Y. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters. BMC Cancer. 10, 229 (2010).
- Connelly, J., et al. Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement. BMC Cancer. 16 (1), (2016).
