تحديد التردد المثبط الأمثل للخلايا السرطانية باستخدام حقول علاج الورم (تفيلدس)
Summary
حقول علاج الورم (تفيلدس) هي طريقة فعالة لمكافحة ورم العلاج تسليمها عن طريق تطبيق مستمر، غير موسع من منخفض الكثافة، وسيطة التردد، والتناوب المجالات الكهربائية. تفيلدس تطبيق لخطوط الخلايا باستخدام تفيلدس في نظام تطبيق المختبر يسمح لتحديد التردد الأمثل الذي يؤدي إلى أعلى انخفاض في عدد الخلايا.
Abstract
ورم علاج الحقول (TTFields) ما يقدر طريقة علاج فعال تسليمها عبر مستمر، وتطبيق موسع من انخفاض الكثافة (1-3 V / سم)، بالتناوب المجالات الكهربائية في مدى التردد من عدة مئات من كيلو هرتز. ويتم دراسة TTFields في زراعة الأنسجة خارج باستخدام TTFields في تطبيق نظام المختبر، والذي يسمح لتطبيق الحقول الكهربائية الترددات وشدة لأطباق بتري السيراميك متفاوتة مع ثابت العزل الكهربائي العالي (ɛ> 5000). تتعرض خطوط الخلايا السرطانية مطلي coverslips على في الجزء السفلي من أطباق بتري السيراميك لTTFields تسليمها في اتجاهين متعامدين على ترددات مختلفة لتسهيل الاختبارات نتائج العلاج، مثل عدد الخلايا والمقايسات مولد الرمع. توضح النتائج المعروضة في هذا التقرير أن وتيرة الأمثل للTTFields فيما يتعلق بكل من عدد الخلايا والمقايسات مولد الرمع هو 200 كيلو هرتز لكل من خلايا المبيض والورم.
Introduction
ورم الحقول علاج (TTFields) هي طريقة لمكافحة الإنقسامية لعلاج ورم أرومي الأشكال وأنواع السرطان الأخرى المحتملة. يتم تسليم الحقول عن طريق التطبيق المستمر من انخفاض الكثافة (1-3 V / سم)، متوسطة التردد (100-500 كيلو هرتز)، بالتناوب المجالات الكهربائية لمنطقة الورم 1، 2. تم عرض تطبيق TTFields في التجارب المختبرية والحية لمنع كل من نمو مختلف خطوط الخلايا السرطانية وتطور الأورام في عدة نماذج ورم الحيوان 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7. التجارب السريرية التجريبية والدراسات العشوائية الكبيرة في المرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة، بما في ذلك ورم أرومي وسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة، لديهم demonstتقييم سلامة وفعالية مستمرة تطبيق TTFields 8 و 9 و 10. تم العثور على فعالية TTFields أن تكون: (1) التردد يعتمد، مع الترددات المثلى محددة مما يؤدي إلى أعلى انخفاض في عدد خلايا من خطوط الخلايا من أصول مختلفة 1، 2، 4، 5، 6، 7؛ (2) شدة المجال الكهربائي التي تعتمد، مع عتبة الحد الأدنى للنشاط في حوالي 1 V / سم وأكثر فعالية شدة ارتفاع 1، 2، 7، 11؛ (3) تعزيز عندما كانت مدة العلاج يعد 5؛ و (4) أعلى عندما طبقت 2 TTFields الاتجاه عموديا على كل شركة أوراسكوم تليكوم القابضةإيه، بالمقارنة مع المجالات الكهربائية المطبقة من اتجاه واحد 1 . استنادا إلى النتائج المذكورة أعلاه، تفيلدز يمكن تطبيقها على المرضى لفترات طويلة باستخدام 2 مجموعات من صفائف محول المترجمة على الجلد المرضى لتعظيم شدة المجال الكهربائي في السرير الورم 12 ، 13 .
دراسة آثار تفيلدس على الخلايا السرطانية في المختبر يوفر حاليا الطريقة الوحيدة لتحديد التردد الأمثل لتطبيق على نوع ورم معين. يتطلب اختبار التردد الأمثل جهاز يسمح بتطبيق ترددات مختلفة في نطاق 100-500 كيلو هرتز وبشدة تصل إلى 3 V / سم الجذر متوسط مربع (رمز) إلى ثقافة الخلية. كما تفيلدس تطبيق تنتج الحرارة، ونظام التطبيق يتطلب القدرة على تبديد الحرارة المفرطة مع الحفاظ على رقابة صارمة على درجة الحرارة.
عدة أجهزة ويره وضعت على مر السنين للسماح لتطبيق TTFields إلى مزارع الخلايا 1، 2، 5، 14، 15، 16. في كل من هذه الأجهزة، تم عزل الأقطاب المستخدمة من أجل تجنب المحاذير تشارك مع استخدام أقطاب كهربائية موصلة، مثل تبادل الإلكترون على سطح القطب والإفراج عن ايونات المعادن السامة في المتوسط 1. والفرق الرئيسي بين مختلف النظم والتطبيقات TTFields اختبار هو نوع من العزل الكهربائي المستخدمة، سواء مع الأقطاب الكهربائية المصنوعة من الأسلاك المعدنية المعزولة مع طبقة رقيقة من عازل 2، 14، 15، 16 أو بمادة عازلة ثابت عالية (على سبيل المثال، المغنيسيوم يؤدي niobate الرصاص titanate (بن-بت)) 6 . في حين أن الأسلاك الكهربائية المعزولة تقدم حلا بسيطا نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لتطبيق تفيلدس، فإنها غالبا ما تقتصر على الجهد العالي المطلوب لتحقيق كثافة المجال الكهربائي فعالة فوق 1 V / سم عتبة والسطح المتاحة للطلاء الخلية، كما المسافة بين الأقطاب صغيرة نسبيا. النظم القائمة على الأقطاب الكهربائية معزولة باستخدام مواد عازلة عازلة عالية تتطلب تصميم خاص وقدرات التصنيع، لكنها لا تتطلب الجهد العالي ويمكن أن توفر مساحة أكبر لنمو الخلايا بين الأقطاب.
و تفيلدس في تطبيق نظام المختبر المستخدمة في هذا العمل ينتمي إلى فئة الأخيرة من النظم، مع الوحدة الأساسية كونها طبق بتري (تفيلدس طبق، انظر الشكل 1 ) تتألف من ارتفاع عازل السيراميك المستمر ( أي بن-بت). يتم طباعة اثنين من أزواج من الأقطاب عموديا على المحفظة الخارجيةليرة سورية للطبق TTFields للسماح لتطبيق الحقول الكهربائية من 2 الاتجاهات. يتم توصيل الأقطاب الكهربائية إلى مولد الموجي الجيبية ومكبر للصوت، والتي تسمح للتطبيق TTFields في مدى التردد من 50-500 كيلو هرتز. من أجل تبديد الحرارة المفرطة، ويتم الاحتفاظ أطباق TTFields داخل الحاضنة المبردة، مع المتوسطة التحكم في درجة الحرارة منفذة باستخدام الرصد المستمر للحرارة صحن وتعديلات على الجهد المطبق من قبل النظام. من الناحية العملية، فإن وضع الحاضنة لانخفاض درجة الحرارة يؤدي إلى ارتفاع شدة المجال الكهربائي، حيث ان النظام يزيد من الجهد حتى يتم تحقيق درجة الحرارة المستهدفة داخل الطبق. الفرق بين درجة الحرارة داخل الطبق ودرجة حرارة الحاضنة قد يؤدي إلى بعض التبخر، اعتمادا على التدرجات درجة الحرارة؛ وبالتالي، يحتاج مستنبت أن تستبدل كل 24 ساعة للحفاظ على ظروف النمو المناسبة.
بروتوكول أدناهيصف الإجراء التجريبي لتحسين تطبيق الترددات تفيلدس إلى الخلايا السرطانية بحيث يتم تحقيق الحد الأقصى للحد في عدد الخلايا وانخفاض في إمكانات الخلايا الباقية على قيد الحياة لتشكيل المستعمرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفيلدس هي طريقة مضادة للورم الناشئة استنادا إلى التطبيق المستمر للمجالات الكهربائية بالتناوب ضبطها بشكل صحيح 1 ، 2 ، 8 ، 9 ، 10 ، 17 . تعظيم فعالية المضادة للورم هو نتيجة مرغوبة لجميع طرائق العلاج. وبالتالي، "القتال" لكل نسبة إضافية من تثبيط نمو الخلايا السرطانية قد يكون لها تأثير كبير على النتيجة السريرية على المدى الطويل للمرضى. ويرجع ذلك إلى الطبيعة المستمرة المطلوبة لتطبيق تفيلدس وما يترتب على ذلك من أثر تراكمي. تعظيم تطبيق تفيلدس يمكن أن يتحقق في عدة طرق: (1) زيادة كثافة المجال الكهربائي 1 ، 7 ، (2) إطالة مدة العلاج 5 ، (3) العثور على كومبيناتي الأكثر فعاليةمع طرائق العلاج الأخرى 18 و 19 و (4) تحديد التردد الأمثل 1 و 2 و 4 و 6 و 7 . يتم تحقيق أقصى قدر من كثافة المجال الكهربائي في موقع الورم عن طريق تحسين موقع المصفوفات على الجلد المريض. وهذا يسمح لتسليم شدة المجال القصوى إلى الورم على أساس التشريح الفردي للمريض 20 . ويعتمد طول مدة العلاج في الغالب على امتثال المريض للعلاج (لمدة 18 ساعة في اليوم على الأقل) 17 . العثور على الجمع الصحيح مع العلاجات الأخرى وتحديد التردد الأمثل يعتمد بشكل كبير على النتائج في المختبر ، كما لا توجد علامات التحقق من صحة لنتائج العلاج تفيلدس متوفرة حاليا. في هذا العمل، حددنا التجربة pالجرع المطلوبة لتحديد تردد تفيلدس الأمثل لخطوط الخلايا السرطانية باستخدام تفيلدس في نظام تطبيق المختبر . يمكن استخدام الطرق الموصوفة هنا لفحص مجموعة من طرائق علاج السرطان الأخرى (على سبيل المثال، عوامل العلاج الكيميائي أو التشعيع) مع تفيلدس وتحديد التردد الأمثل لإدارة تفيلدس لكل علاج مجتمعة محددة.
وتمشيا مع المنشورات السابقة، أظهرت النتائج المعروضة هنا أن التردد الأمثل لعلاج كل من خلايا الورم وخلايا سرطان المبيض هو 200 كيلو هرتز 1 ، 7 . في هذا العمل، أثبتنا لأول مرة أن تردد تفيلدس الأمثل للحد من إمكانات كلونوجينيك يرتبط مع التردد الذي يؤدي إلى التأثير السامة للخلايا القصوى. الأساليب المستخدمة في هذا العمل لقياس آثار تفيلدس ( أي السامة للخلايا والمكونة) aإعادة اثنين فقط من العديد من المقايسات نقطة النهاية القياسية المحتملة لتقييم نتائج العلاج. وتشمل اختبارات نتائج العلاج إضافية: (1) تحديد، تلطيخ، وتركيب كوفرسليبس التي يتم مطلي الخلايا على المجهر لتصور الهياكل داخل الخلايا. (2) إجراء فحوصات البروتين ومستخلصات الحمض النووي الريبي، إما من الأطباق تفيلدس أنفسهم أو بعد نقل ساترة إلى طبق جديد المتاح. و (3) تريبسينيزينغ الخلايا الملون لتحليل التدفق الخلوي.
وسيؤثر التخطيط التجريبي الدقيق على نتائج العلاج بعد تسليم تفيلدس. وتشمل الخطوات الرئيسية ضمان أن انتشار الخلايا في جميع أنحاء التجربة لا يؤدي إلى فرط واستخدام كثافة المجال الكهربائي المناسب، كما شدة التي هي مرتفعة جدا عند تطبيقها على خطوط الخلايا الحساسة سوف يؤدي إلى خلايا قليلة جدا للمقايسات المطلوبة لتحديد التردد الأمثل. على العكس من ذلك، تفيلدس تطبيقها في شدة منخفضة جداعلى خطوط الخلايا أقل حساسية يؤدي إلى آثار صغيرة قد تكون ملثمين من قبل الاختلاف المتأصل. وينبغي فحص سجلات العلاج للحصول على معلومات قيمة بشأن استقرار درجة الحرارة، التيارات الكهربائية، ومقاومة لكل طبق في جميع أنحاء التجربة. استبدال الأطباق الخاطئة في بداية العلاج واستبعاد البيانات من الطبق الذي لم يستوف معايير العلاج المرغوبة سوف تقلل من التباين بين مكررات.
باختصار، تفيلدس هي طريقة العلاج المضادة للسرطان الناشئة التي أثبتت بالفعل فعالية وسلامة في البيئات السريرية 8 ، 9 ، 10 . اختبار تفيلدس في إعداد في المختبر باستخدام البروتوكولات الموصوفة هنا قد تسمح لتحسين معلمات العلاج تفيلدس في الإعداد السريري وقد توسع فهمنا لآلية العمل الكامنة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ليس لديهم اعترافات.
Materials
| inovitro system and software | Novocure | ITG1000 and IBP1000 | Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable. |
| Sterilization bags | Westfield medical | 24882 | |
| Plastic cover slides | Thermo Scientific (NUNC) | 174977 | Pre treated and sterilized |
| Glass cover slides | Thermo Scientific (Menzel-Gläser) | CB00220RA1 | Sterilize if necessary |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Biological Industries (Israel) | 01-055-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries (Israel) | 04-007-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco | 25030-029 | |
| Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 µg/mL Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate solution 100 mM | Biological Industries (Israel) | 03-042-1B | |
| Hepes buffer 1M | Biological Industries (Israel) | 03-025-1B | |
| Insuline solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10516-5ML | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Biological Industries (Israel) | 03-050-1B | Warm in 37 °C water bath before use |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Cool to -20 °C in the freezer before use |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 120M1445 | Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water. |
| Light detergent | Alcononx | 242985 | Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer's instrutions. |
| PBS | Biological Industries (Israel) | 02-023-1A | Without calcium and magnesium |
| A2780 | ECACC | 93112519 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM). |
| F98 | ATCC | CRL-2397 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| Ovcar-3 | ATCC | HTB-161 | Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 µg/mL). |
| U-87 MG | ATCC | HTB-14 | Grow in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 µg/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM). |
| refrigirated CO2 incubator | CARON | 7404-10-3 | |
| Laminar flow cabinet | ADS Laminair | Bio12 and VSM12 |
References
- Kirson, E. D., et al. Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).
- Kirson, E. D., et al. Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields. Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).
- Gera, N., et al. Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Giladi, M., et al. Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields. Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).
- Giladi, M., et al. Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells. Sci Rep. 5, 18046 (2015).
- Giladi, M., et al. Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo. Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).
- Voloshin, T., et al. Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo. Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).
- Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &, D. A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).
- Stupp, R., et al. Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial. JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).
- Stupp, R., et al. NovoTTF-100A versus physician’s choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality. Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).
- Kanner, A. A., et al. Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician’s choice chemotherapy. Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).
- Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &, J. P. Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma. Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).
- Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas. Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).
- Kim, E. H., et al. Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation. Oncotarget. , (2016).
- Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &, M. Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis. Oncotarget. , (2016).
- Pavesi, A., et al. Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application. Sci Rep. 6, 26584 (2016).
- Wong, E. T., Lok, E., Swanson &, D. K. Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation. Cancer Med. , (2015).
- Kirson, E. D., et al. Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields). BMC Med Phys. 9, (2009).
- Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &, Y. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters. BMC Cancer. 10, 229 (2010).
- Connelly, J., et al. Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement. BMC Cancer. 16 (1), (2016).
