Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

ADN está sob constante ataque de agentes exógenos, tais como a radiação, luz ultravioleta, toxinas ambientais, produtos de combustão, etc. Além disso, também é atacado por espécies de radicais endógenos produzidos pelo metabolismo oxidativo. Todos estes têm o potencial de perturbar química ou fisicamente a integridade do DNA ^1. Perturbações no genoma pode ativar a resposta DNA danos (DDR), um recrutamento e modificação cascata pós translacional com centenas, se não milhares, de proteínas e microRNAs envolvidos na reparação da lesão, regulação do ciclo celular, apoptose, senescência e vias inflamatórias ^2.

A maioria do nosso informações sobre o DDR vem de estudos com LAP. Isto é em grande parte devido à disponibilidade de tecnologias para a introdução de intervalos, incluindo a sequência de intervalos específicos, em ADN genómico em células vivas ^3. Além disso, o propensity de quebras para induzir focos de proteínas DDR, que podem ser visualizados por imunofluorescência, tem sido muito útil para identificar a cinética e requisitos de proteínas que respondem. Uma das principais tecnologias para estudar a DDR foi introduzido por Bonner e seus colegas, que usou um feixe de laser para dirigir uma faixa de LAP em uma "região de interesse" (ROI) nos núcleos de células vivas ^4. Com efeito, eles criaram um foco longa em que as proteínas do DDR puderam ser identificados por imunofluorescência. Isto foi ilustrado por sua demonstração de uma forte banda de histona H2AX fosforilada (γ-H2AX) nas células de laser exposta. Desde então, a abordagem de laser tem sido utilizada em vários estudos do DDR induzidas por LAP. Embora poderoso e popular, e da origem das imagens de imunofluorescência dramáticas, deve-se notar que na maioria dos experimentos a intensidade do laser é ajustada de modo a produzir resultados observáveis, sem preocupação com a identidade da lesão,densidade, ou espaçamento. Na verdade, pode ser difícil fazer estas estimativas. Assim, eles são largamente ignorado, apesar da multiplicidade de lesões introduzidas no ADN por lasers ^5. Isso contribui para as muitas contradições na literatura ^6.

Em contraste com o LAP, a maioria das modificações químicas de DNA não estimulam a formação de focos discretos de proteínas DDR. Isto é importante à luz de nossa compreensão atual das frequências de lesão. Estimou-se que as células humanas em cultura incorrer em tantos como 50 LAP por ciclo celular, em grande parte formadas durante a fase S ^{7, 8, 9.} Menos são formadas em células não proliferantes. Isto contrasta com o número de perdas de bases nucleoticas ou eventos de modificação, que são na casa das dezenas de milhares por célula / dia ^{1, 10.} Assim, sabemos mais sobreDDR induzida por eventos que são relativamente raros, e muito menos sobre as induzidas por lesões hélice de distorção, que no seu conjunto são muito mais comuns.

A fim de abordar questões sobre a resposta celular ao covalentes modificações do DNA genômico, queríamos trabalhar com uma hélice distorcendo aduto de DNA que tinham actividade de indução DDR inerente. Além disso, para facilitar a concepção experimental e interpretação estávamos interessados ​​em uma estrutura cuja introdução pode ser controlada em relação ao tempo e era passível de visualização. Nesse sentido, desenvolvemos uma estratégia baseada em psoraleno. Os psoralenos são bem caracterizado intercaladores de ADN fotoactivos que favorecem 5' TA: AT locais. Ao contrário de outros agentes de reticulação, tais como mostardas de azoto e a mitomicina C (MMC) eles não são de DNA reactivo a menos expostos ao longo de onda de UV (UVA) luz. As moléculas intercalares reagir com bases de timina em cadeias opostas para produzir hélice distorcer reticulações intercadeias (ICLs) ^11. Com o psoraleno trimetil usadas nas nossas experiências maior parte dos produtos são relativamente poucas, ICLs monoaductos são gerados (menos do que 10%) ^{de 12,} e ligações cruzadas entre as bases intracadeia adjacentes numa cadeia não são formados. Porque eles são blocos poderosos para a replicação e transcrição, psoraleno e outros agentes de reticulação, como cis-platina e MMC, são comumente utilizados na quimioterapia. Assim activado psoraleno estudos que se seguiram à activação da RDA por uma estrutura de distorção hélice, e também uma percepção sobre a resposta celular a um composto com importância clínica.

Nós sintetizado um reagente em que psoraleno trimetil foi ligada à digoxigenina (Dig), um esterol vegetal não encontrado em células de mamíferos e frequentemente utilizado como um immunotag. O requisito para fotoactivação permite a localização por luz laser (365 nm) de ICLs psoraleno em ROI definida em núcleos em células vivas. Estes podem ser exibidos por immunofluorescence contra a tag Dig. Reparação do ADN e proteínas de DDR apareceu nas listras do laser de localizadas ICLs ^{13, 14.}

A DDR activado pelas intensidades elevadas laser usado para produzir LAP pode ser devido a danos isolado ou agrupado ^{15, 16.} Por consequência, a relevância dos resultados destas experiências a lesões que ocorrem naturalmente, presentes em concentração muito mais baixa, é incerto. Para abordar questões semelhantes sobre a frequência aduto psoraleno e espaçamento no DNA, aproveitamos a tecnologia de fibra DNA ¹⁷ e pontos immunoquantum. Pontos quânticos são muito mais brilhantes do que corantes fluorescentes e não são branqueados pela exposição à luz. Assim, eles são frequentemente utilizadas para uma única molécula de imagem ^18, um pedido para que os corantes fluorescentes não são suficientemente brilhante. ADN fibras individuais pode ser esticada em glass lâminas e pode ser apresentado por imunofluorescência contra análogos de nucleósido incorporadas durante incubações anteriores para a célula de colheita. Nós células tratadas com Dig-psoraleno e exposto a irradiação para ROI micro laser. As fibras foram preparados a partir das células e aductos de DIG-psoraleno individuais poderia ser visualizado com os pontos immunoquantum. A exposição das células a análogos de nucleósidos para períodos de tempo relativamente curto (20-60 minutos) permite a visualização de tractos de replicação na vizinhança dos ICLs a laser localizada.