واحدة تحليل جزيء من الليزر المترجمة السورالين Adducts

الحمض النووي هو تتعرض لهجوم مستمر من وكلاء خارجي مثل الإشعاع، والأشعة فوق البنفسجية، والسموم البيئية، ونواتج الاحتراق، الخ بالإضافة إلى ذلك، تعرضت لهجوم من قبل أيضا الأنواع المتطرفة الذاتية التي تنتجها عملية الأيض التأكسدي. كل هذه لديها القدرة على تعطيل كيميائيا أو فيزيائيا على سلامة DNA ^1. الاضطرابات في الجينوم يمكن تنشيط الاستجابة DNA الأضرار (DDR)، والتوظيف وآخر متعدية سلسلة تعديل مع مئات، إن لم يكن الآلاف، من البروتينات وmicroRNAs المشاركة في إصلاح الآفة، وتنظيم دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، الشيخوخة، ومسارات للالتهابات ^2.

معظم المعلومات التي لدينا حول DDR يأتي من الدراسات مع DSBs. هذا هو في جزء كبير نظرا لتوافر تكنولوجيات لإدخال فواصل، بما في ذلك فواصل محددة تسلسل، في الحمض النووي الجيني في الخلايا الحية ^3. بالإضافة إلى ذلك، propensitذ فواصل للحث على بؤر البروتينات DDR، والتي يمكن أن يتحلى بها المناعي، كانت مفيدة جدا لتحديد حركية ومتطلبات البروتينات الاستجابة. وقدم واحدة من التكنولوجيات الرئيسية لدراسة DDR التي كتبها بونر والزملاء، الذين استخدموا شعاع ليزر لتوجيه شريط من DSBs في "منطقة الاهتمام" (ROI) في نوى الخلايا الحية ^4. في الواقع، وأنشأوا التركيز مطول التي يمكن من خلالها تحديد البروتينات من DDR المناعي. وقد تجلى ذلك من خلال مظاهرتهم من شريط قوي من H2AX هيستون فسفرته (γ-H2AX) في الخلايا الليزر عرضة للخطر. منذ ذلك الحين، تم توظيف النهج الليزر في العديد من الدراسات من DDR الناجمة عن DSBs. وعلى الرغم من قوة وشعبية، ومصدر الصور المناعي مثيرة، وتجدر الإشارة إلى أنه في معظم التجارب يتم ضبط كثافة الليزر وذلك لتحقيق نتائج ملحوظة، من دون قلق للهوية الآفة،الكثافة، أو تباعد. في الواقع، يمكن أن يكون من الصعب وضع هذه التقديرات. وبالتالي فإنها يتم تجاهل إلى حد كبير، على الرغم من تعدد الإصابات التي أدخلت الحمض النووي عن طريق الليزر ^5. هذا يساهم في العديد من التناقضات في الأدب ^6.

وعلى النقيض من DSBs، معظم التعديلات الكيميائية من DNA لا تحفز تشكيل بؤر منفصلة من البروتينات DDR. وهذا أمر مهم في ضوء فهمنا الحالي للترددات الآفة. وتشير التقديرات إلى أن خلايا الإنسان في الثقافة تتحمل ما يصل الى 50 DSBs في دورة الخلية، شكلت إلى حد كبير خلال المرحلة S ^{7 و 8 و 9.} وتشكل أقل في الخلايا غير المتكاثرة. وهذا يتناقض مع عدد من الخسائر nucleobase أو الأحداث التعديل، والتي هي في عشرات الآلاف في كل خلية / يوم ^{1 و 10.} وهكذا، ونحن نعرف أكثر عنوDDR الناجمة عن الأحداث التي هي نادرة نسبيا، وأقل بكثير عن تلك الناجمة عن الحلزون تشويه الآفات، والتي في مجموعها هي أكثر شيوعا بكثير.

ومن أجل التصدي لأسئلة حول الاستجابة الخلوية لالتساهمية التعديلات من الحمض النووي الجيني، أردنا أن نعمل مع الحلزون تشويه ناتج إضافة DNA الذي كان ملازم النشاط DDR الاستقراء. وعلاوة على ذلك، لتسهيل التصميم التجريبي والتفسير نحن مهتمون في هيكل التي يمكن السيطرة عليها فيما يتعلق الوقت، وكانت قابلة للتصور المقدمة. وفقا لذلك، وضعنا إستراتيجية تعتمد على السورالين. Psoralens تتميز أيضا intercalators DNA متفاعل صالح 5 "TA: AT المواقع. على عكس وكلاء يشابك الأخرى مثل الخردل النيتروجين وميتوميسين C (MMC) أنهم ليسوا الحمض النووي رد الفعل ما لم تتعرض لموجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية (UVA) الضوء. جزيئات مقحم تتفاعل مع قواعد الثايمين على مسارات معاكسة لإنتاج الحلزون تشويه crosslinks interstrand (ICLS) ^11. مع السورالين ثلاثي المستخدمة في تجاربنا معظم المنتجات ICLS، يتم إنشاء عدد قليل monoadducts نسبيا (أقل من 10٪) ^12، وcrosslinks intrastrand بين القواعد المجاورة على واحدة حبلا لا تتشكل. لأنهم كتل قوية لتكرار والنسخ، السورالين وغيرها من العوامل يشابك، مثل رابطة الدول المستقلة البلاتين وMMC، وتستخدم عادة في العلاج الكيميائي. وبالتالي تمكين السورالين الدراسات التي أعقبت تفعيل DDR من قبل الحلزون تشويه هيكل، وقدم أيضا نظرة ثاقبة على الاستجابة الخلوية للمجمع مع أهمية سريرية.

نحن توليفها كاشف الذي ارتبط السورالين ثلاثي لdigoxigenin (حفر)، وستيرول النبات لا توجد في خلايا الثدييات، وكثيرا ما تستخدم باعتبارها immunotag. شرط لتنشيط ضوئي يسمح التعريب بواسطة ضوء الليزر (365 نانومتر) من ICLS السورالين في العائد على الاستثمار المحددة في نوى في الخلايا الحية. هذه يمكن عرضها من قبل IMMunofluorescence ضد العلامة حفر. إصلاح الحمض النووي والبروتينات DDR ظهرت في خطوط الليزر المترجمة ICLS ^{13 و 14.}

وDDR تفعيلها من خلال كثافة الليزر العالية المستخدمة لإنتاج DSBs يمكن أن يكون راجعا إلى معزولة أو تتجمع الضرر ^{15 و 16.} وبالتالي، فإن أهمية نتائج هذه التجارب لتحدث بشكل طبيعي الآفات والحاضر تركيز على أقل من ذلك بكثير، غير مؤكد. لمعالجة مسائل مماثلة حول تردد ناتج إضافة السورالين والتباعد في الحمض النووي، وإننا قد استفادت من تكنولوجيا الألياف DNA ¹⁷ والنقاط immunoquantum. النقاط الكمومية هي أكثر إشراقا بكثير من الأصباغ الفلورية ولا المبيض عن التعرض للضوء. وهكذا في كثير من الأحيان يتم استخدامها للتصوير جزيء واحد ^18، وهو التطبيق الذي الأصباغ الفلورية مشرقة بما فيه الكفاية. الألياف DNA الفردية يمكن أن تمتد على زالشرائح معشوقة ويمكن عرضها من قبل المناعي ضد نظائرها نيكليوزيد أدرجت خلال حضانات قبل الخلية الحصاد. كنا نعامل والخلايا مع حفر-السورالين وتعرض عائد الاستثمار لأشعة الليزر الدقيقة. أعدت ألياف من الخلايا وadducts-حفر السورالين الفردية يمكن تصوره مع النقاط immunoquantum. تعريض الخلايا لنيكليوزيد نظائرها لأوقات قصيرة نسبيا (20-60 دقيقة) يسمح عرض مساحات النسخ المتماثل في محيط ICLS الليزر المترجمة.