Одно Молекула Анализ лазерных локализованные псоральны аддукты

ДНК находится под постоянным нападением от экзогенных агентов, таких как облучение ультрафиолетового света,, токсины окружающей среды, продукты сгорания и т.д. Кроме того, он также атакован эндогенными радикальных частицами, полученных путем окислительного метаболизма. Все они имеют потенциал , чтобы химически или физически нарушить целостность ДНК ^1. Возмущения в геноме может активировать ДНК Damage Response (DDR), а набор и пост трансляционной модификации каскада с сотнями, если не тысячи, белков и микроРНК, участвующих в репарации повреждений, регуляции клеточного цикла, апоптоза, старении и воспалительных путей ^2.

Большая часть нашей информации о DDR в исследованиях с DSBs. Это в значительной степени из – за наличие технологий для внедрения брейков, включая последовательность конкретных разрывы, в геномной ДНК в живых клетках ^3. Кроме того, propensitу обрывов, чтобы вызвать фокусы DDR белков, которые могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции, было очень полезно для определения кинетики и требований реагирующих белков. Одной из ключевых технологий для изучения DDR был представлен Боннэр и коллегами, которые использовали лазерный луч направить полосу DSBs в «области интереса» (ROI) в ядрах живых клеток ^4. В сущности, они создали длинный фокус, в котором белки DDR могут быть определены с помощью иммунофлюоресценции. Это было проиллюстрировано их демонстрацией сильной полосы фосфорилированного гистона H2AX (γ-H2AX) в лазерном воздействии клеток. С тех пор лазерный подход был использован в многочисленных исследованиях DDR, индуцированных DSBs. Хотя мощный и популярный, и источник драматических образов иммунофлюоресценции, следует отметить, что в большинстве опытов интенсивности лазерного излучения регулируют таким образом, чтобы наблюдаемые результаты, не заботясь о личности поражения,плотность, или промежуток. На самом деле, это может быть трудно сделать эти оценки. Таким образом , они в значительной степени игнорируются, несмотря на множественность поражений , введенных в ДНК с помощью лазеров ^5. Это способствует много противоречий в литературе ^6.

В отличие от DSBs, большинство химических модификаций ДНК не стимулируют образование дискретных очагов DDR белков. Это очень важно в свете современного понимания частоты поражения. Было подсчитано , что человеческие клетки в культуре несут целых 50 DSBs за клеточный цикл, сформированных в основном во время S фазы ^{7, 8, 9.} Меньшее образуются в не пролиферирующих клеток. Это контрастирует с количеством потерь нуклеотидных или модификации событий, которые в десятки тысяч на клетку / день ^{1, 10.} Таким образом, мы знаем больше всегоДДР индуцируется событиями, которые являются относительно редких, и гораздо меньше о тех, индуцированных спирали искажая поражения, которые в совокупности являются гораздо более распространенным явлением.

Для решения вопросов о клеточном ответе на ковалентные модификации геномной ДНК, мы хотели работать с спиралью искажая ДНК аддукта, который имел присущую DDR индукции активности. Кроме того, для облегчения опытно-конструкторских и интерпретации мы были заинтересованы в структуре которого введение можно контролировать по времени и был поддается визуализации. Соответственно, мы разработали стратегию, основанную на псоралене. Псоралено хорошо охарактеризованы светочувствительные интеркаляторы ДНК, благоприятствующие 5' TA: AT сайтов. В отличии от других сшивающих агентов, таких как азот горчица и митомицин C (MMC) они не являются ДНК-реактивными, если не подвергаются воздействию длинноволнового ультрафиолетового (УФ) света. Интеркалированные молекулы реагируют с основаниями тимина на противоположных нити для производства спирали искажая interstrand сшивок (ICL,) ^11. С триметили псорально , используемые в наших экспериментах большинство продуктов ICLS, относительно мало monoadducts генерируется (менее 10%) ¹² и intrastrand сшивки между соседними основаниями на одной нити не образуются. Поскольку они являются мощными блоками для репликации и транскрипции, псорально и других сшивающих агентов, как цис-платина и MMC, которые обычно используется в химиотерапии. Таким образом, псорально включено исследование, которые следовали за активацию DDR с помощью спиральной искажающей структуры, а также обеспечили понимание клеточного ответ на соединение с клинической значимостью.

Мы синтезировали реагент, в котором триметил псорален был связан с дигоксигенином (Dig), растительный стерин не найден в клетках млекопитающих и часто используется в качестве immunotag. Требование фотоактивации позволяет локализацию с помощью лазерного света (365 нм) псорален ICL, в определенной ROI в ядрах в живых клетках. Они могут быть отображены IMMunofluorescence против тега Dig. Репарации ДНК и белки DDR появились в полосах лазера локализованных ICLS ^{13, 14.}

DDR активируется с помощью лазера высокой интенсивности , используемой для производства DSBs может быть связан с изолированным или кластерным повреждением ^{15, 16.} Следовательно, актуальность результатов этих экспериментов в природе поражения, присутствующие в значительно меньшей концентрации, является неопределенным. Для решения подобных вопросов о псоралена частоте аддукта и расстоянии в ДНК, мы воспользовались ДНК волоконной технологии ¹⁷ и immunoquantum точек. Квантовые точки намного ярче, чем флуоресцентные красители и не отбеливают под воздействием света. Таким образом , они часто используются для визуализации одной молекулы ^18, приложение , для которого флуоресцентные красители являются недостаточно яркими. Отдельные волокна ДНК могут быть растянуты на гLass слайды и могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции против аналогов нуклеозидов, включенных во инкубационных перед клеточным урожаем. Мы обрабатывали клетки с Dig-псораленом и разоблачили ROI для лазерной микро-облучения. Волокна были получены из клеток и отдельных Dig-псорален аддуктов могут быть визуализированы с immunoquantum точками. Воздействие на клетки аналогам нуклеозидов в течение относительно короткого времени (20-60 мин) позволяет отображать трактов репликации в непосредственной близости от лазера локализуется МКСТ.