Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

ADN est sous attaque constante des agents exogènes tels que le rayonnement, la lumière ultraviolette, les toxines environnementales, les produits de combustion, etc. De plus, il est également attaqué par des espèces radicalaires endogènes produits par le métabolisme oxydatif. Tous ces éléments ont le potentiel de perturber chimiquement ou physiquement l'intégrité de l' ADN ^1. Perturbations dans le génome peut activer l'ADN réponse Damage (DDR), un recrutement et cascade post traductionnelles avec des centaines, voire des milliers, de protéines et microARN impliqués dans la réparation des lésions, la régulation du cycle cellulaire, l'apoptose, la sénescence et les voies inflammatoires ^2.

La plupart de nos informations sur le DDR proviennent d'études avec DSB. Cela est en grande partie en raison de la disponibilité des technologies pour l' introduction de pauses, y compris les pauses spécifiques de séquence, dans l' ADN génomique dans les cellules vivantes ^3. De plus, le propensity des pauses pour induire des foyers de protéines DDR, qui peuvent être affichés par immunofluorescence, a été très utile pour identifier la cinétique et les exigences des protéines répondant. L' une des technologies clés pour l' étude de la DDR a été présenté par Bonner et ses collègues, qui ont utilisé un faisceau laser pour diriger une bande de DSB dans une « région d'intérêt » (ROI) dans les noyaux des cellules vivantes ^4. En effet, ils ont créé un foyer long dans lequel les protéines de la DDR pourraient être identifiés par immunofluorescence. Cela a été illustré par la démonstration de la bande forte de l'histone H2AX phosphorylée (γ-H2AX) dans les cellules exposées au laser. Depuis lors, l'approche laser a été utilisé dans de nombreuses études de la DDR induites par DSB. Bien que puissant et populaire, et la source d'images dramatiques immunofluorescence, il convient de noter que, dans la plupart des expériences l'intensité du laser est ajustée de manière à produire des résultats observables, sans se soucier de l'identité de la lésion,la densité, ou l'espacement. En effet, il peut être difficile de faire ces estimations. Ainsi , ils sont largement ignorés, malgré la multiplicité des lésions introduites dans l' ADN par des lasers ^5. Cela contribue aux nombreuses contradictions dans la littérature ^6.

Contrairement aux DSB, la plupart des modifications chimiques de l'ADN ne stimulent pas la formation de foyers discrets de protéines DDR. Ceci est important à la lumière de notre compréhension actuelle des fréquences de lésion. Il a été estimé que les cellules humaines en culture subissent moins de 50 DSB par cycle cellulaire, en grande partie formés au cours de la phase S ^{7, 8, 9.} Moins sont formées dans des cellules non proliférantes. Cela contraste avec le nombre de pertes de nucléobases ou des événements de modification, qui sont des dizaines de milliers par cellule / jour ^{1, 10.} Nous savons donc le plusle DDR induite par des événements qui sont relativement rares, et beaucoup moins sur celles qui sont induites par des lésions des effets de distorsion de l'hélice, ce qui, au total, sont beaucoup plus fréquents.

Afin de répondre à des questions sur la réponse cellulaire à covalentes modifications de l'ADN génomique, nous voulions travailler avec un produit d'addition d'ADN de distorsion d'hélice qui avait inhérente l'activité d'induction de DDR. De plus, pour faciliter la conception expérimentale et l'interprétation que nous étions intéressés par une structure dont l'introduction pourrait être contrôlée par rapport au temps et était prête à la visualisation. Par conséquent, nous avons développé une stratégie basée sur psoralène. Les psoralènes sont bien caractérisés intercalants d'ADN favorisant photoactifs 5' TA: AT sites. Contrairement à d'autres agents de reticulation tels que les moutardes d'azote et de la mitomycine C (MMC), ils ne sont pas l'ADN réactif à moins exposé aux UV onde longue (UVA). Les molécules intercalées réagissent avec les bases thymine sur des brins opposés pour produire des reticulations entre brins de distorsion d'hélice (CIST) ^11. Avec le psoralène triméthyl utilisé dans nos expériences la plupart des produits sont ICL, relativement peu monoadducts sont générés (moins de 10%) ¹² et des réticulations entre les bases intrabrin adjacentes sur un brin ne sont pas formés. Parce qu'ils sont des blocs puissants à la réplication et la transcription, psoralène et d'autres agents de réticulation, comme le cis-platine et MMC, sont couramment utilisés en chimiothérapie. Ainsi psoralène permis d'études qui ont suivi l'activation du DDR par une structure de distorsion de l'hélice, et a également fourni un aperçu de la réponse cellulaire à un composé ayant une importance clinique.

Nous avons synthétisé un réactif dans lequel psoralène triméthyl était lié à la digoxigénine (Dig), un stérol végétal ne se trouve pas dans les cellules de mammifères et souvent utilisé comme immunotag. L'exigence de photoactivation permet la localisation par la lumière laser (365 nm) de psoralène CIST en ROI défini dans les noyaux dans des cellules vivantes. Ceux-ci peuvent être affichés par immunofluorescence contre l'étiquette Dig. Réparation de l' ADN et des protéines DDR est apparu dans les bandes de laser localisés ICL ^{13, 14.}

Le DDR activé par les fortes intensités de laser utilisées pour produire des DSB peut être dû à des dommages isolés ou regroupés ^{15, 16.} Par conséquent, la pertinence des résultats de ces expériences à des lésions d'origine naturelle, présente une concentration beaucoup plus basse, est incertain. Pour répondre à des questions similaires sur la fréquence des produits d'addition psoralène et l' espacement dans l' ADN, nous avons profité de la technologie de fibre d'ADN ¹⁷ et des points de immunoquantum. Les points quantiques sont beaucoup plus lumineux que les colorants fluorescents et ne sont pas blanchies par exposition à la lumière. Ainsi , ils sont fréquemment utilisés pour l' imagerie de la molécule unique ^18, une application pour laquelle les colorants fluorescents sont pas suffisamment brillante. fibres d'ADN individuelles peuvent être étirées sur gdiapositives lass et peuvent être affichées par immunofluorescence contre analogues nucléosidiques incorporés au cours incubations avant la récolte des cellules. Nous avons traité les cellules avec Dig-psoralène et le retour sur investissement exposés à une irradiation par micro laser. Les fibres ont été préparées à partir des cellules et des produits d'addition individuels Dig-psoralène peut être visualisée avec les points de immunoquantum. Exposer les cellules à des analogues nucléosidiques pendant des durées relativement courtes (20-60 min) permet l'affichage des voies de réplication dans le voisinage de la CIST localisée au laser.