Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi
Summary
Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.
Abstract
DNA hasarı yanıt (DDR) yaygın olarak canlı hücreler lazer mikro ışın demeti radyasyonu ile indüklenen çift iplik kırılmaları (DSB'ler) çalışmalarında karakterize edilmiştir. DDR kol içi çapraz bağlantılar DNA (ICLs) de dahil olmak üzere kovalent DNA modifikasyonları bozucu sarmalı için, hem de tanımlanmamıştır. Biz canlı hücrelerin çekirdeklerinde, immunotagged psoralenler laser fotoaktivasyon tarafından lokalize ICLs tarafından uyarılan DDR, inceledik. yaklaşımlı dağıtım ve çoğaltma çatal karşılaşmalar hakkında temel sorulara cevap bulmak amacıyla, biz iki diğer teknolojilerle lazer yerelleştirme birleştirdi. DNA, elyaf genellikle kısa darbeler sırasında eklenen nükleosit analoglarının immünofloresansla replikasyon çatalları ilerleyişini görüntülemek için kullanılır. Immunoquantum noktalar yaygın tek bir molekül görüntüleme için kullanılmıştır. yeni bir yaklaşım ise, lazer lokalize ICLs taşıyan hücreler DNA lifler mikroskop lamı üzerine yayılır. Etiketlenmiş ICLs immunoquantum noktalar ve inci ile görüntülenirE arası lezyon mesafeleri tespit edilmiştir. ICLs ile Çoğaltma çatal çarpışmalar görülebilir ve farklı karşılaşma desenler belirlendi ve miktarı belirlenir.
Introduction
DNA, ek olarak, bu oksidatif metabolizma tarafından üretilen endojen radikal türleri tarafından saldırıya vb radyasyon, ultraviyole ışık, çevresel toksinler, yanma ürünleri gibi eksojen maddeler sürekli saldırı altındadır. Bunların hepsi, kimyasal veya fiziksel olarak DNA 1 bütünlüğünü bozmak için potansiyele sahiptir. genomunda pertübasyonlar lezyon onarımında yer alan proteinleri ve mikroRNA binlerce değilse, yüzlerce, DNA hasarına (DDR), bir işe ve post-translasyonel modifikasyonlar kaskadını aktive edebilirler, hücre döngüsü, apoptoz, yaşlanma ve inflamatuar yolların düzenlenmesi 2.
DDR hakkındaki bilgilerin çoğu DSBs ile çalışmalardan gelmektedir. Bunun nedeni canlı hücreler 3'te genomik DNA'da, sekans spesifik sonları dahil, sonları tanıştırmak için teknolojilerin kullanılabilirliği büyük ölçüde olduğunu. Buna ek olarak, propensitsonları y immünofloresansla görüntülenebilir DDR proteinlerin odakları indükleme, kinetik ve yanıt proteinlerinin gereksinimlerini tanımlanması için yararlı olmuştur. DDR eğitimi için anahtar teknolojilerden biri canlı hücreler 4 çekirdeklerinde bir "İlgi Bölgesi" içinde DSBs bir şerit yönlendirmek için (YG) bir lazer ışını kullanılır Bonner ve arkadaşları tarafından tanıtıldı. Aslında, onlar DDR proteinler Immünofloresan tarafından tespit edilebilir ki uzun bir odak oluşturdu. Bu lazer maruz bırakılmış hücreler içinde fosforile histon H2AX güçlü şerit (γ-H2AX) kendi gösterilmesiyle izah edildi. O zamandan beri, lazer yaklaşım DSBs tarafından uyarılan DDR sayısız çalışmalarda kullanılmıştır. Güçlü ve popüler ve dramatik immünfloresans görüntülerin kaynağı olsa da, lezyon kimlik kaygısı olmadan, gözlemlenebilir sonuçlar üretmek üzere en deneylerinde lazer yoğunluğu ayarlanır unutulmamalıdıryoğunluk ya da aralık. Gerçekten de, tahminler yapmak zor olabilir. Böylece büyük ölçüde lazerler 5 ile DNA içine lezyonların çokluğu rağmen göz ardı edilir. Bu literatürde 6'da birçok çelişkiler katkıda bulunur.
DSBs aksine, DNA'nın çoğu kimyasal modifikasyonlar, DDR proteinlerin ayrı kümelerle oluşumunu teşvik etmemektedir. Bu lezyon frekanslarının mevcut anlayış ışığında önemlidir. Kültürde insan hücreleri S fazında 7, 8, 9 sırasında büyük ölçüde oluşan hücre döngüsü başına 50 kadar DSBs, tabi olduğu tahmin edilmiştir. Daha az çoğalmayan hücrelerden oluşur. Bu hücre / gün 1, 10 başına binlerce olan nükleobaz kayıp veya değişiklik olaylarının sayısı ile tezat teşkil etmektedir. Böylece, en biliyorNispeten nadir bulunur ve bütünüyle çok daha yaygındır sarmal bozan lezyonlar, neden oldukları hakkında çok az olan olaylar neden olduğu DDR.
Genomik DNA modifikasyonları kovalent hücresel yanıtı hakkında sorulara cevap bulmak amacıyla, biz doğal DDR indüksiyon aktivitesine sahip bir helezon bozan DNA adükt ile çalışmak istediğini. Dahası, deneysel tasarım kolaylaştırmak ve yorumlama kimin giriş zamana göre kontrol edilen ve görselleştirme edilebilir niteliktedir edilebilecek bir yapıda ilgi için. Buna göre, psoralen dayalı bir strateji geliştirdi. siteleri: AT psoralenler de 5' TA lehine fotoaktif DNA araya karakterize edilir. nitrojen hardalları ve mitomisin C (MMC) uzun dalga UV (UVB) ışığa maruz sürece, DNA reaktif değildir gibi diğer çapraz bağlama maddeleri aksine. birleştirilmiş moleküller sarmal bozan içi çapraz bağlantılar üretebilme karşıt şeritler üzerindeki timin bazların (ICLs ile reaksiyona) 11. Deneylerde kullanılan trimetil psoralen ile en ürünleri oluşmadığı nispeten az monoadüktler içeren gruptan (% 10'dan az) oluşturulur ICLs, 12 ve bir iplik üzerindeki bitişik bazlar arasında şerit-arası çapraz bağları olan. bunlar sis-platin ve MMC gibi replikasyon ve transkripsiyon, psoralen ve diğer çapraz bağlama maddeleri, güçlü blok için, yaygın olarak kemoterapi kullanılır. Bu nedenle, psoralen bir helis bozan yapı ile DDR aktivasyonunu takip ve aynı zamanda klinik öneme sahip bir bileşiğin hücresel tepki ilişkin bilgi temin çalışmalar sağladı.
Bu trimetil psoralen digoksijenin (DIG) ile bağlantılı olduğu bir reaktif sentezlenmiş, bir bitki sterol memeli hücrelerinde bulunan ve sık sık bir immunotag olarak kullanılmaz. fotoaktivasyon şartı canlı hücrelerde çekirdek tanımlanan ROI içinde psoralen ICLs lazer ışığına (365 nm) ile konumlandırılmasına olanak vermektedir. Bunlar imm tarafından görüntülenebilirKazı etiketine karşı unofluorescence. DNA onarımı ve DDR proteinleri ICLs 13, 14 lokal lazer çizgili ortaya çıktı.
DSBs üretilmesi için kullanılan yüksek lazer yoğunlukları ile aktive DDR izole edilmiş ya da kümelenmiş hasar 15, 16 nedeniyle olabilir. Sonuç olarak, bu deneyden elde edilen sonuçlar ile ilgisi doğal lezyonlar, bu çok daha düşük bir konsantrasyonda meydana için, kesin değildir. DNA psoralen adükt sıklığı ve aralığı ile ilgili benzer soruları için, DNA elyaf teknolojisi 17 ve immunoquantum noktaların yararlandı. Kuantum nokta floresan boyalar daha parlak ve ışığa maruz kalma ile ağartılmış değildir. Bu nedenle sık sık, tek molekül görüntüleme 18 için kullanılan bir uygulama olan floresan boyalar yeterince parlak. Bireysel DNA lifler g üzerinde gerilebilirkız slaytlar ve hasat hücre önce inkubasyon sırasında dahil nükleosid analogları karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Biz Dig-psoralen ile hücreleri tedavi ve lazer mikro ışınımına yatırım getirisi teşhir etti. Elyaf immunoquantum noktalarla görüntülenebildi hücrelerin ve tek tek Dig-psoralen adüktleri hazırlanmıştır. nispeten kısa sürelerde (20-60 dakika), nükleozid analogları ile hücrelerin maruz lazer lokalize ICLs yakın çoğaltma yolları görüntü ile birlikte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lazer lokalizasyon teknolojisi parlak alan mikroskopisi de görebilir çekirdekleri yapışan hücrelerin kullanımını gerektirmektedir. Böyle polilisin veya kolajen veya daha fazla kompleks karışımlar olarak hücre yapıştırma preparatları ile cam yüzeyine, örneğin primer lenfositler, ya da AD293 olarak gevşek bir şekilde yapışık kültürlenmiş hücreler gibi yapışmayan hücreler, takmak için çalışılmıştır. bu tedaviler yüzeye hücreleri bağlamak olsa bile, genellikle çok zor çekirdekler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma (Z01 AG000746-08) ve Fanconi Anemisi Araştırma Fonu Yaşlanma üzerine NIH, Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O’Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage – when is a DSB not a DSB?. Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
