レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

DNAはまた、それはまた、酸化的代謝によって産生される内因性ラジカル種に襲われるなど、放射線、紫外線、環境有害物質、燃焼生成物、などの外因性物質から一定の攻撃の下にあります。これらのすべては、化学的または物理的DNA ¹の完全性を破壊する可能性があります。ゲノムにおける摂動は、病変の修復に関与するタンパク質とマイクロRNAのない場合は、何千、何百ものDNA損傷応答（DDR）、リクルートおよび翻訳後修飾カスケードを活性化することができ、細胞周期、アポトーシス、老化、および炎症経路の調節^2。

DDRについての私たちの情報のほとんどは、DSBは用いた研究から来ています。これは、生きた細胞³のゲノムDNAに、配列特異的な休憩を含め、休憩を導入するための技術の利用可能性に大部分です。また、propensit免疫蛍光法によって表示することができDDRタンパク質、巣を誘導する切断のyは、タンパク質の応答の動態と要件を識別するために非常に役立っています。 DDRを研究するための重要な技術の一つは、生きた細胞⁴の核に「関心領域」にDSBのストライプを指示する（ROI）のレーザービームを使用ボナーや同僚、によって導入されました。実際に、彼らはDDRのタンパク質が免疫蛍光法によって識別することができたに長い焦点を作成しました。これは、レーザ曝露された細胞におけるリン酸化ヒストンH2AX（γ-H2AX）の強力なストライプのそれらの実証によって示されました。それ以来、レーザーアプローチは、DSBはによって誘発されるDDRの多くの研究で採用されてきました。パワフルで人気の、そして劇的な免疫蛍光画像のソースが、病変のアイデンティティを心配することなく、観察可能な結果を​​生成するために、ほとんどの実験ではレーザー強度を調整することに留意すべきです密度、または間隔。確かに、これらの見積りを行うことが困難な場合があります。したがって、それらは主にレーザー⁵によってDNAに導入された病変の多数にもかかわらず、無視されます。これは、文献⁶には多くの矛盾に貢献しています。

DSBは対照的に、DNAのほとんどの化学修飾は、DDRタンパク質の離散病巣の形成を刺激しません。これは、病変の周波数の私達の現在の理解の光の中で重要です。培養中のヒト細胞がS期^7、8、9中大きく形成され、細胞周期あたりのような多くの50のDSBを招くと推定されています。少数の非増殖細胞に形成されています。これは、セル/ ¹日目^、10あたり数万である核酸塩基の損失または変更イベントの数とは対照的です。したがって、我々は、最大で約知っていますDDRは比較的まれであるイベント、および集計にはるかに共通している螺旋歪曲病変によって誘発されるものについてあまりにより誘発されます。

ゲノムDNAの共有結合修飾に対する細胞応答についての質問に対処するために、我々は固有のDDR誘導活性を有していたDNA付加体を歪まリックスで動作するように望んでいました。さらに、実験デザインや解釈を容易にするために、我々は時間にその導入に関して制御することができた構造に興味を持っていたと可視化に適しました。したがって、我々はソラレンに基づいた戦略を開発しました。サイトで：ソラレンはよく5' TAを好む光活性DNAインターカレーターを特徴としています。長波紫外線（UVA）光にさらされない限り、このようなナイトロジェンマスタード及びマイトマイシンC（MMC）のような他の架橋剤とは異なり、それらはDNA反応性ではありません。インターカレート分子は螺旋歪ま間架橋を生成するために、反対の鎖上のチミン塩基（のICLと反応します^）11。私たちの実験で使用したトリメチルソラレンではほとんどの製品が形成されていない比較的少ないモノ付加物が（10％未満）が生成されているの^ICL、12、および一方の鎖上の隣接する塩基間の鎖内架橋があります。彼らは複製および転写、ソラレンおよび他の架橋剤を強力にブロックされているので、シスプラチンとMMCのように、一般的な化学療法で使用されています。したがってソラレンヘリックス歪ま構造によりDDRの活性化に続いて、また、臨床的重要性を有する化合物に対する細胞応答への洞察を提供した研究を可能にしました。

私たちは、トリメチルソラレンは（DIG）をジゴキシゲニンにリンクされた試薬を合成し、植物ステロールは、哺乳動物細胞中に見出され、頻繁にimmunotagとして使用されていません。光活性化のための要件は、生細胞中の核に定義されたROIにおけるソラレンのICLのレーザ光（波長365nm）によって局在化を可能にします。これらは、IMMで表示することができますディグタグに対するunofluorescence。 DNA修復およびDDRタンパク質はのICL ^13、14ローカライズレーザのストライプ状に現れました。

DSBを生成するために使用される高レーザ強度によって活性化DDRは、単離されたまたはクラスタ化された損傷^15,16に起因するかもしれません。その結果、はるかに低い濃度で存在し、自然に病変を発生するために、これらの実験からの結果の関連性は、不確実です。 DNAにおけるソラレン付加頻度と間隔について同様の質問に対処するために、我々は、DNAの繊維技術¹⁷とimmunoquantumドットを利用しました。量子ドットは、蛍光色素よりもはるかに明るい光への曝露によって漂白されていません。従って、それらはしばしば単一分子イメージング^18、蛍光色素が不十分明るいされるアプリケーションのために使用されます。個々のDNA繊維は、Gに延伸することができますLASSスライド前細胞収穫にインキュベーション中に組み込まれるヌクレオシド類似体に対して免疫蛍光によって表示することができます。我々は、DIGソラレンで細胞を処理し、レーザマイクロ照射にROIを露出します。繊維は、細胞から調製し、個々のDig-ソラレン付加物はimmunoquantumドットで可視化することができます。比較的短い時間（20-60分）類似体ヌクレオシドに細胞を曝露することレーザ局在のICLの近傍における複製トラクトの表示を可能にします。