Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

DNA wordt voortdurend aanval door exogene middelen zoals bestraling, ultraviolet licht, giftige stoffen, verbrandingsproducten, etc. Daarnaast wordt ook aangetast door endogene radicalen geproduceerd door oxidatief metabolisme. Deze hebben het potentieel om de integriteit van DNA ¹ chemisch of fysisch te verstoren. Verstoringen in het genoom kan de DNA Damage Response (DDR), een werving en post-translationele modificatie cascade met honderden te activeren, zo niet duizenden, van eiwitten en microRNAs die betrokken zijn bij laesie reparatie, regulatie van de celcyclus, apoptose, veroudering, en inflammatoire pathways ^2.

De meeste van onze informatie over de DDR afkomstig uit studies met DSB. Dit is grotendeels vanwege de beschikbaarheid van technieken voor het inbrengen pauzes, zoals sequentiespecifieke onderbrekingen, in genoom DNA in levende cellen ^3. Bovendien, de propensity van pauzes om brandpunten van DDR-eiwitten, die kan worden weergegeven door immunofluorescentie veroorzaken, is zeer nuttig geweest voor het identificeren van de kinetiek en eisen te reageren eiwitten. Een van de belangrijkste technologieën voor het bestuderen van de DDR werd geïntroduceerd door Bonner en collega's, die een laserstraal in de kernen van levende cellen ⁴ gebruikt om een streep van DSB's te richten in een "Region of Interest" (ROI). In feite, creëerden ze een langdurige focus op welke eiwitten van de DDR konden worden geïdentificeerd met immunofluorescentie. Dit werd geïllustreerd door de demonstratie van de sterke streep gefosforyleerd histon H2AX (γ-H2AX) in de laser-belichte cellen. Sindsdien is de laser aanpak toegepast in tal van studies van de DDR veroorzaakt door DSB. Hoewel krachtig en populair, en de bron van dramatische immunofluorescentie beelden, dient te worden opgemerkt dat in de meeste experimenten de laser intensiteit wordt aangepast om waarneembare resultaten te produceren, zonder zorg voor laesie identiteit,dichtheid of tussenruimte. Inderdaad, kan het moeilijk zijn om deze schattingen te maken. Aldus worden zij grotendeels genegeerd, ondanks het grote aantal laesies in DNA geïntroduceerd door lasers ^5. Dit draagt bij aan de vele tegenstrijdigheden in de literatuur ^6.

In tegenstelling tot DSB meeste chemische modificaties van DNA niet de vorming van afzonderlijke foci van DDR eiwitten stimuleren. Dit is belangrijk in het licht van onze huidige kennis van laesie frequenties. Er wordt geschat dat menselijke cellen in kweek gebracht wel 50 DSB's per celcyclus grotendeels gevormd tijdens S-fase ^{7, 8, 9.} Minder gevormd in niet-prolifererende cellen. Dit in tegenstelling tot het aantal nucleobase verlies of wijziging gebeurtenissen, die in de tienduizenden per cel / dag ^{1, 10.} Dus, we weten het meest overde DDR opgewekt door gebeurtenissen die relatief zeldzaam, en veel minder over die geïnduceerd door helix vervormen laesies, die globaal slechts veel vaker voorkomen.

Met het oog op vragen over de cellulaire respons op wijzigingen van genoom DNA covalente aan te pakken, willen we aan de slag met een helix verstorende DNA adduct dat inherent DDR inductieactiviteit gehad. Verder naar experimenteel ontwerp te vergemakkelijken en de interpretatie we geïnteresseerd waren in een structuur waarvan het binnenbrengen zou kunnen worden gecontroleerd met betrekking tot de tijd en was vatbaar voor visualisatie. Daarom ontwikkelden we een strategie gebaseerd op psoralen. Psoralenen goed gekarakteriseerd fotoactieve DNA intercalerende begunstiging 5'TA: AT sites. In tegenstelling tot andere verknopingsmiddelen zoals stikstof mosterd en mitomycine C (MMC) niet met DNA reactief indien blootgesteld aan lange golf UV (UV) licht. De geïntercaleerde moleculen reageren met thymine basen aan tegenoverliggende strengen helix vervormen crosslinks tussen de strengen te produceren (ICL) ^11. Met trimethyl psoralen gebruikt in onze experimenten meeste producten ICLs, relatief weinig monoadducten gegenereerd (minder dan 10%) ¹² en intrastrengs verknopingen tussen aangrenzende basen op één streng worden gevormd. Omdat ze krachtige blokken replicatie en transcriptie, psoraleen en andere verknopingsmiddelen, zoals cis-platina en MMC, worden vaak gebruikt bij chemotherapie. Zo psoralen ingeschakeld studies dat de activering van de DDR, gevolgd door een helix vervormen structuur, en ook inzicht gegeven in de cellulaire reactie op een verbinding met de klinische belang.

We synthetiseerden een reagens waarin trimethyl psoralen is verbonden met digoxigenine (Dig), een plantensterol niet in zoogdiercellen en vaak gebruikt als immunotag. De vereiste fotoactivatie maakt lokalisatie met laserlicht (365 nm) van psoraleen ICLs in vastgestelde ROI kernen in levende cellen. Deze kunnen worden weergegeven door immunofluorescence tegen de Dig tag. DNA herstel en DDR eiwitten verscheen in de strips van laser gelokaliseerde ICLs ^{13, 14.}

De DDR geactiveerd door de hoge laserintensiteiten gebruikt voor DSB's te produceren kan het gevolg zijn geïsoleerde of geclusterde schade ^{15, 16.} Bijgevolg is de relevantie van de resultaten van deze experimenten natuurlijk voorkomende laesies aanwezig bij veel lagere concentratie, is onzeker. Op soortgelijke vragen over psoraleen adduct frequentie en tussenruimte in het DNA aan te pakken, hebben we geprofiteerd van DNA vezeltechnologie ¹⁷ en immunoquantum stippen. Quantum dots zijn veel helderder dan fluorescerende kleurstoffen en zijn niet gebleekt door blootstelling aan licht. Zo worden ze vaak gebruikt voor single molecule imaging ¹⁸ de toepassing waarvoor fluorescente kleurstoffen onvoldoende licht. DNA afzonderlijke vezels kunnen worden gespannen op glass schuiven en kan worden weergegeven door immunofluorescentie tegen nucleoside analogen ingebracht gedurende incubaties vóór oogst cel. We behandelde cellen met Dig-psoraleen en blootgesteld de ROI te laser micro bestraling. Vezels werden bereid uit de cellen en individuele Dig-psoraleen adducten kunnen worden gevisualiseerd met de immunoquantum stippen. Blootstellen van de cellen aan nucleoside-analogen relatief korte tijd (20-60 min) maakt de weergave van replicatie streken in de nabijheid van de laser gelokaliseerde ICL.