Человеческие развитие нервной системы расстройство, такие как микроцефалия, может быть плохо изучено только на животных моделей из-за того, что мозг человека имеет расширенную корковую поверхность, уникальную особенность, отличающуюся от животных, кроме человека.

Этот аспект делает развитие мозга человеческим сложный процесс , который не может быть достаточно изучен в 2D, в пробирке системы культивирования клеток. Новые методы 3D культур позволяют генерировать подобные ткани органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Дифференцировки в пробирке плюрипотентных стволовых клеток в 3D культуры подвески допускает образование различных типов клеток в области своевременного и конкретным образом, что приводит к организованной, стратифицированной ткани ^{1, 2, 3.} Благодаря лаборатории, пионеры технологии 3D культур и демистифицировали сложность формирования органов, начиная от стволовых клеток,мы разработали надежный метод генерации органоиды мозга разграничить ранние события развития человеческого мозга и смоделировать микроцефалия в пробирке ^{1, 2, 3.} Следует отметить , что мы адаптировали оригинальный метод , разработанный Lancaster и др. генерировать церебральных органоиды ^1. Этот метод был модифицирован в соответствии с нашими экспериментальными требованиями.

Целью исследования с Габриэль и соавт. был проанализировать клеточные и молекулярные механизмы нейронального поддержания стволовых клеток в процессе развития мозга. Для того чтобы сделать это, механистическое исследование проводили с помощью анализа нейронных клеток – предшественников (НПС) в 3D органоидов головного мозга , полученных от пациента ⁴ микроцефалии. Этот пациент нес мутацию в ППДЕ, законсервированный центросомном белок , необходимый для центросом биогенеза ^5. Широко принято гипо-тезис , что микроцефалия является результатом истощения пула NPC, и это может быть обусловлено либо к гибели клеток или к преждевременной дифференцировке ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Путем анализа желудочковых зон (VZS) микроцефалия органоидов мозга, было показано , что значительное число НПСА подвергается асимметричному делению клеток, в отличии от органоидов мозга , полученных от здорового донора ^4. Обширные микроскопические и биохимические анализы микроцефальных органоидов мозга выявили неожиданную роль для ППДА в своевременной ресничек разборке ^4. В частности, мутировали CPAP связано с запаздывающим реснички разборки и отсроченной клеточного цикла повторного входа, что приводит к преждевременному дифференциации РНУ ^4. Эти результаты указывают на роль ресничек в микроцефалии и йEIR участие в процессе нейрогенеза и размера мозга управления ^10.

Первая часть этого протокола является описанием способа трехступенчатого для создания однородных органоидов мозга. Как упоминалось ранее, оригинальный протокол Lancaster был адаптирован и изменен в соответствии с нашей цели ^1. Во-первых, человеческие иПСК культивируют в определенном без фидерного слоя условие на матрице Engelbreth-Холм-рой (ГЭП). Этот шаг позволяет избежать вариаций фидерных-зависимых культур плюрипотентных стволовых клеток. В этом протоколе, индукция дифференцировки нервной с образованием нейронной эпителии начинается непосредственно из ИПСКА. Путем пропуска шага эмбриоидного тела (EB) образования, нейронная дифференциация протекает в более контролируемый и направленный образе. Этот подход ограничивает спонтанное и неориентированное образование других слоев зародышевых клеток, такие как мезодермы и энтодерма. Применяя этот протокол, нейросферы содержащие нейронные розетки могут быть собраны на 5-й день для EHS матрицы вложение и стационарные суспензионной культуры. Органоид среда, используемая для третьего этапа нашего протокола дополняется dorsomorphin и SB431542. Dorsomorphin является ингибитором малых молекул костного морфогенетического белка (BMP), и SB431542 ингибирует / активин / узловой сигнальный путь TGF-beta. Сочетание этих факторов может способствовать нейронной дифференциации более эффективны , чем в одиночку ^{11, 12, 13, 14} ретиноевой кислоте.

В целом, эти модификации позволяют воспроизводимое поколение органоидов мозга, с минимальными различиями между органоидами. Важно отметить, что этот метод был применен для генерации энергично микроцефальных органоидов мозга от ИПСКА пациентов, которые несут мутации в генах, которые влияют на центросомы и динамику клеточного цикла.

Вторая часть этого протокола дает указание по подготовке брAin органоиды для анализа и интерпретации клеточных дефектов в микроцефалии. Это включает в себя фиксацию, cryosectioning, иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальной микроскопический анализ. Этот протокол обеспечит читатель с подробным описанием ожидаемых результатов и руководством для интерпретации.