IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기
Summary
Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
Abstract
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
Introduction
같은 소두증과 같은 인간의 신경 발달 장애는 단지 가난으로 인해 인간의 두뇌가 확장 된 대뇌 피질의 표면, 인간이 아닌 동물과는 다른 독특한 기능을 가지고 있다는 사실을 동물 모델에서 공부하실 수 있습니다.
이 측면은 인간의 두뇌 발달을 충분히 체외 세포 배양 시스템에서, 2 차원에서 연구 할 수없는 복잡한 과정을 수 있습니다. 신흥 3D 배양 기술은 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 조직 형 organoids의 생성을 허용한다. 차원 현탁 배양에서 다 능성 줄기 세포의 체외 분화 조직, 층상 조직의 1, 2, 3를 야기한, 적시 영역 특정 수단으로 각종 종류의 세포를 형성 할 수있다. 3D 문화 기술을 개척하고 줄기 세포에서 시작, 기관 형성의 복잡성을 신화화 실험실 덕분에,우리는 인간의 두뇌 발달의 초기 이벤트를 묘사하고 시험관 1, 2, 3 소두증을 모델링 뇌 organoids를 생성하는 강력한 방법을 개발했다. 우리가 랭카스터 동부 등에 의해 개발 된 일본어 방법을 채택하는 것이 주목된다. 대뇌 organoids 1을 생성한다. 이 방법은 우리의 실험 요구 사항에 따라 수정되었습니다.
가브리엘 등의 알에서 연구의 목적. 두뇌 개발하는 동안 신경 줄기 세포의 유지 보수의 세포 및 분자 메커니즘을 분석했다. 이를 위해, 기계 론적 연구는 소두증 환자 4에서 파생 된 3D 뇌 organoids에서 신경 전구 세포 (NPC들)을 분석하여 수행되었다. 이 환자는 CPAP, 중심체 생합성 5에 필요한 보존 centrosomal 단백질에 돌연변이를 실시했다. 널리 인정 저자논문 소두증는 NPC 풀의 고갈의 결과 인 것으로하고,이 중 세포 사멸 또는 분화 조기 1, 6, 7, 8, 9에 기인 할 수있다.
소두증 뇌 organoids의 심실 영역 (VZs)를 분석함으로써, NPC의 상당수는 건강한 공여체 (4)로부터 유도 뇌 organoids 달리 비대칭 세포 분열을 겪는 것으로 나타났다. 소두의 뇌 organoids의 광범위한 현미경 및 생화학 분석은 적절 섬모의 분해 4 CPAP에 대한 예기치 않은 역할을 한 것으로 밝혀졌습니다. 구체적으로는, 돌연변이가 CPAP NPC의 조기 (4)의 분화를 초래 지연 섬모 분해 지연 세포주기 재진입와 연관된다. 이러한 결과는 소두증과 일에 섬모의 역할을 제안신경과 뇌의 크기 제어 10시 EIR 참여.
이 프로토콜의 첫 번째 부분은 뇌 균질 organoids를 생성하는 세 단계 방법의 설명이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 원래 랭커스터 프로토콜은 적응하고 우리의 목적 (1)에 맞게 수정되었습니다. 첫째, 인간 iPSCs는 Engelbreth-Holm이 – 스웜 (EHS) 행렬에 정의 된 장치가없는 상태에서 배양했다. 이 단계는 공급에 의존하는 만능 줄기 세포 배양의 변화를 방지 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 신경 분화 유도 신경 상피 iPSCs로부터 시작 형성한다. 배아 체 (EB)의 형성 공정, 및보다 제어 지시하게 신경 분화의 진행을 스킵함으로써. 이 방법은 중배엽 및 내배엽 다른 생식 세포 층의 자발적 무향 형성을 제한한다. 이 프로토콜을 적용하여, 신경 근엽을 포함 neurosphere를가 EH을 위해 5 일에 수확 할 수있다S 행렬 삽입 및 고정 현탁 배양. 우리 프로토콜의 세 번째 단계에 사용 된 배지는 유사 장기 dorsomorphin 및 SB431542로 보충된다. Dorsomorphin 뼈 형태 형성 단백질 (BMP)의 소분자 억제제 및 SB431542은 TGFβ / 티빈 / 절점 신호 전달 체계를 억제한다. 이러한 요인들의 조합은 신경 분화를 더 효율적으로 단독보다 11, 12, 13, 14, 레티노 산을 촉진 할 수있다.
요컨대, 이러한 수정은 organoids에서 최소한의 변화로, 뇌 organoids의 재현 세대 수 있습니다. 중요한 것은,이 방법은 견고 중심체와 세포주기 역학에 영향을 미치는 유전자 변이를 가지고 환자 iPSCs에서 소두의 뇌 organoids를 생성하기 위해 적용되었다.
이 프로토콜의 두 번째 부분은 BR을 준비하는 지침을 제공합니다아인은 분석 및 소두증의 세포 결함의 해석 organoids. 이것은 고정, 저온 절편, 면역 형광 염색법, 및 공 촛점 현미경 분석을 포함한다. 이 프로토콜은 예상 된 결과에 대한 자세한 설명과 해석에 대한 안내와 함께 독자를 제공 할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCPH는 생체 내에서 또는 단순 인간의 세포 배양 시험관에 접근에서 동물 모델에서 효과적으로 요약 할 수없는 복잡한 인간의 신경 발달 장애이다. MCPH의 임상 양상은 초기 신경이 시작될 때 첫 번째 임신 동안 표시하기 시작합니다. 따라서, 3D 뇌 organoids는 MCPH 개발을 모델링하는 신뢰할 수있는 실험 시스템을 나타냅니다. 또한, 3D 인간 뇌 organoids는 중요한, ⅲ) 다양한 분화 I)들은 다양…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 프리츠 티센 재단 (Az.10.14.2.152)에 의해 지원되었다. 우리는 조직 삽입 시설 및 CMMC의 현미경의 핵심 시설에 감사하고 있습니다. 우리는 중심체와 세포 뼈대 생물학 연구소의 회원들에 의해 제공되는 토론 및 기술 지원에 대한 감사합니다. 우리는 원고를 교정하기위한 이명 Gooi 감사합니다.
Materials
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
| CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
| Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
| Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
| Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
| PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
| Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
| Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
| Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
| Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
| waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?. Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D’Avanzo, C., et al. Alzheimer’s in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).
